[發(fā)明專利]一種溶血性貧血患者外周血單核細(xì)胞的分離方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510583400.4
• 申請(qǐng)日: 2015-09-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105112373A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 卓凡清;馬健穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海麥禾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0786
• 分類號(hào): C12N5/0786
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種溶血性貧血患者外周血單核細(xì)胞的分離方法。

背景技術(shù)溶血性貧血(hemolyticanemia，HA)，指紅細(xì)胞破壞加速，而骨髓造血功能代償不足時(shí)發(fā)生的一類貧血。溶血(hemolysis)是紅細(xì)胞遭到破壞，壽命縮短的過(guò)程。骨髓具有正常造血6～8倍的代償能力，當(dāng)溶血超過(guò)骨髓的代償能力，引起的貧血即為溶血性貧血；當(dāng)溶血發(fā)生而骨髓能夠代償時(shí)，可無(wú)貧血，稱為溶血狀態(tài)(hemolyticstate)。溶血性貧血的根本原因是紅細(xì)胞壽命縮短，而造成紅細(xì)胞破壞加速的原因可概括為兩個(gè)方面：紅細(xì)胞本身的內(nèi)在缺陷和紅細(xì)胞外部因素異常。前者多為遺傳性溶血，后者引起獲得性溶血。其中，紅細(xì)胞內(nèi)在缺陷主要包括紅細(xì)胞膜缺陷、紅細(xì)胞酶缺陷、珠蛋白異常等。紅細(xì)胞外部因素異常主要包括免疫性因素、非免疫性因素。溶血性貧血的臨床表現(xiàn)主要與溶血過(guò)程持續(xù)的時(shí)間和溶血的嚴(yán)重程度有關(guān)。

目前單核細(xì)胞分離技術(shù)，多采用Ficoll-Hypaque(d＝1.077)分層法：即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分層法；主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，是一種單次密度梯度離心分離法。聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖(商品名為Ficoll)，分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無(wú)毒性的特點(diǎn)。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細(xì)胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶液，密度為1.020，添加比重為1.200的泛影葡胺(urografin)以增加密度。國(guó)外常用商品Isopaque或Hypaque，故又稱Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適的分層液。分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，因?yàn)槿说募t細(xì)胞密度為1.093，粒細(xì)胞密度為1.092，單個(gè)核細(xì)胞在1.076～1.090之間。分離時(shí)先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或磷酸鹽緩沖液PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個(gè)清晰的界面。水平式離心后，離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢(qián)狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％～95％。

但是現(xiàn)有的淋巴細(xì)胞分離技術(shù)主要針對(duì)正常人的靜脈血，分離效果較好。但是對(duì)溶血性貧血患者，分離效果較差，常混有大量破碎紅細(xì)胞和血小板，導(dǎo)致后期淋巴細(xì)胞質(zhì)量不高，后期擴(kuò)大培養(yǎng)很難。

發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種分離效果好，破碎的紅細(xì)胞和血小板基本不殘留的溶血性貧血患者外周血單核細(xì)胞的分離方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種溶血性貧血患者外周血單核細(xì)胞的分離方法，所述分離方法包括以下步驟：

1)取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，低速離心，共分為三層，將頂層的富血小板血漿液面層除去；

2)往離心管中加入濃度為3％明膠生理鹽水溶液，對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行重懸；

3)將重懸的細(xì)胞溶液自然沉淀60-70min，收集離心管中的明膠懸液層，并離心棄去上層清液；

4)往離心管中加入無(wú)血清培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞；

5)將重懸的細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液的液面上，離心并將離心管中層白霧狀細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的離心管中；

6)對(duì)白霧狀細(xì)胞層進(jìn)行離心，除上清，再加入PBS溶液，重懸洗滌，重復(fù)兩次，加入無(wú)血清AIM-V培養(yǎng)基配置成懸液備用。

本發(fā)明中，先對(duì)溶血性貧血患者外周血進(jìn)行低速離心，去除上層的血小板，然后往底部沉淀的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞液中加入3％明膠生理鹽水溶液自然沉淀，從而進(jìn)一步去除紅細(xì)胞。將經(jīng)前面步驟預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞懸液，再通過(guò)步驟4和步驟5的再次分離，除去明膠、淋巴細(xì)胞分離液等溶液，從而達(dá)到提高分離效果，避免血小板和紅細(xì)胞殘留的目的。

進(jìn)一步，所述步驟1)具體為：取溶血性貧血患者外周血加入離心管中，20℃，200×g離心10-20min，溶液共分為三層，將頂層的富血小板血漿液面層除去。本發(fā)明中，通過(guò)較低離心力200×g進(jìn)行離心，使得紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞沉淀的同時(shí)，保證上層清液中含有盡可能多的血小板，達(dá)到高效去除血小板的目的。