[發明專利]一種分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法

在審

• 申請號: 201510582302.9
• 申請日: 2015-09-14
• 公開（公告）號: CN105039275A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 劉慧民;張嬌;王大慶;聶穎;劉記璇;劉冰冰
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種由雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法。

背景技術

硫酸銨分級沉淀和柱層析法是傳統的分離谷胱甘肽過氧化物酶的方法，硫酸銨沉淀法的原理是高濃度的硫酸銨離子在蛋白溶液中與蛋白競爭水分子，從而破壞蛋白表面的水化膜，降低其溶解度并使之從溶液中沉淀出來，因此可利用不同濃度的硫酸銨溶液沉淀溶解度不同的蛋白；柱層析法的原理是蛋白樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同，經多次分配后可將不同蛋白分離。這2項技術原理簡單但實驗過程繁瑣復雜，不僅需要專門的實驗設備和儀器，且分離蛋白時間超長，不能實現蛋白純化和蛋白批量化，因此有待探索新的實驗技術和方法。

Farrell于1975年首次建立了等電聚焦—聚丙烯酰胺雙向凝膠分離和分析蛋白質組的技術，并使用該技術成功分離了約1000個蛋白質。這就是后來的二維雙向凝膠電泳技術(Two-dimensionalgelelectrophoresis)，并于20世紀70年代初廣泛應用，隨著該技術的不斷成熟和完善，其分離蛋白質的精度和特異性越來越高。操作二維雙向凝膠電泳時首先進行等電聚焦，使待分離的各個蛋白按各自的pH梯度分離，至各自的等電點處，再沿垂直方向按蛋白質分子量的不同進行分離。雙向凝膠電泳技術因其原理簡明，操作簡單，分離精準，能批量分離并純化蛋白等特點已能夠應用于分離蛋白質組中所有蛋白，如結合質譜鑒定技術，還能實現蛋白質鑒定等諸多功能。

酶蛋白是蛋白家族中種類最為豐富的一類蛋白，利用二維雙向電泳技術也可以實現酶蛋白精確的分離和純化，谷胱甘肽過氧化物酶是一類參與逆境調解的酶蛋白，是植物體內清除活性氧的重要酶類，能保護生物膜、蛋白質免受活性氧損傷，并具有提高植物抗性的生理功能。因此如能從眾多酶蛋白中單獨分離提純出谷胱甘肽過氧化物酶，就可進一步用于該酶的活性研究、氧化還原與清除氧自由基機理研究、抗逆機制研究、抗逆基因克隆、差異蛋白質組學的相關研究等。因此本發明利用二維雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶。

利用二維雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶，和傳統的分離技術相比，雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶過程中，經過二次電泳后可將該酶蛋白充分分離，提高了蛋白分離的效率和精準度；雙向電泳技術還可實現平行泳道多次加樣和平行樣品重復實驗，因此能一次性得到一定數量的純化酶蛋白，可為其他科學實驗提供充足的酶蛋白樣品；該方法在實驗過程中共經過了3次純化蛋白的操作，保證了所分離的酶蛋白的高純度，可用于對酶蛋白的質量和純度要求很高的底物與蛋白互作等高層次的科學研究，這是傳統的蛋白分離技術所無法比擬和實現的。

發明內容

本發明提供在金山繡線菊中分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，利用二維雙向凝膠電泳技術，通過凝膠掃描和圖像分析、膠內蛋白酶解等技術，建立在金山繡線菊中分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的技術體系，與傳統的提取該酶蛋白的方法相比，利用雙向電泳技術與方法分離純化蛋白具有更高的精確性、可操作性和先進性；該技術方法分離純化的蛋白具有更高的純度、更多的數量和更優的科研價值。

由二維雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，按以下步驟進行：