[發明專利]一種分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法

在審

• 申請號: 201510582302.9
• 申請日: 2015-09-14
• 公開（公告）號: CN105039275A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 劉慧民;張嬌;王大慶;聶穎;劉記璇;劉冰冰
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N9/08
• 分類號: C12N9/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，其特征在于是利用雙向電泳技術分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，按以下方法進行：一、金山繡線菊梯度低溫處理；二、金山繡線菊葉片蛋白質的提取：液氮充分研磨金山繡線菊葉片，加入蛋白提取試劑I，-20℃靜置過夜。低溫過夜后提取液4℃離心2小時留取沉淀，用含0.07％β-巰基乙醇約3倍沉淀體積的冷丙酮重懸沉淀后，在鼓風干燥裝置中抽干沉淀。按30μl/mg比例加入蛋白提取試劑Ⅱ，冰浴后4℃離心1小時留取上清液。三、蛋白質定量與純化：采用標準曲線法進行蛋白定量，按照2D-Quant試劑盒說明進行蛋白純化，純化后的蛋白樣品保存于-80℃冰箱中待用。四、第一相固相PH梯度等電聚焦電泳：取蛋白樣品溶液均勻滴加并充滿膠條槽底部，將膠條輕覆于液層上，在IPGphor電泳儀上進行等電聚焦，聚焦電泳后將膠條分別放入平衡液A、平衡液B中平衡15min，再用雙蒸水充分潤洗瀝干后進行第二相電泳。五、第二相SDS-PAGE凝膠電泳：按常規制膠方法灌制凝膠，之后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。六、凝膠平衡與染色：待電泳結束，蛋白充分分離后取出凝膠，放入固定液中固定，再將凝膠轉移至熱考染液中染色10分鐘，蛋白斑點清晰染色后，凝膠放入乙酸液中脫色，脫色至凝膠背景呈無色狀態。七、凝膠掃描和圖像分析：用UMAX掃描儀掃描染色的聚丙烯酰胺凝膠并獲取電子圖像，利用專業分析軟件2-DImagemasterElitTM分析凝膠圖像，給出各個染色蛋白點的實際分子量和等電點。八、目標蛋白膠內酶解與脫水：在凝膠上準確切取分子量為19.095KDa、PI值為8.98的蛋白點(目標蛋白)，在切取的膠團中加入4-5μl含5ng/μl胰蛋白酶的25mM適量碳酸氫銨溶液，使膠團完全吸漲并酶解12-14小時。將蛋白酶解體系放入60μl的50％乙晴液中脫水45分鐘，再向乙腈液中加入16-18μl0.5％的適量TFA，將蛋白脫水體系放在4℃搖床上振蕩三小時，最后放入真空干燥超速離心機中旋轉干燥成白色膠粒。九、目標蛋白的重結晶與純化：在AnchorChipTM板點樣孔上均勻涂上一層CCA基質，將酶解和脫水后的目標蛋白膠粒放入點樣孔內，滴入0.1％TFA到樣品上并充滿點樣孔，使膠粒迅速溶解并潤洗蛋白，1分鐘內吸出點樣孔內所有溶液以除去操作中對蛋白造成的污染，并重復3次。加入微量重結晶液使蛋白結晶析出保存；其中步驟二中的蛋白提取試劑I的主要成分包括：10％三氯乙酸丙酮溶液，0.07％β-巰基乙醇；蛋白提取試劑Ⅱ的主要成分包括：7.0mol/L尿素，40mmol/L二硫蘇糖醇，4％兩性電解質表面活性劑，2.0mol/L硫脲；步驟四中的平衡液A的成分包括：50mmol/LTris-HCI，pH6.8，8mol/L尿素，30％甘油，1％十二烷基硫酸鈉，0.2％二硫蘇糖醇；平衡液B的成分包括：以3％碘乙酰胺替換平衡液A中的0.2％二硫蘇糖醇并加痕量溴酚藍，其他成分相同；步驟六中固定液主要成分為：40％乙醇：10％乙酸(3:1)；熱考染液配制：微量R350溶于1600ml冰乙酸。步驟九中的重結晶液的成分包括：0.1gCCA溶于6:3:1的乙醇：丙酮：0.1％TFA溶液。

2.根據權利要求1所述的分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，其特征在于步驟一中在秋季露地自然晝夜平均溫度達到15℃時，開始處理試驗材料金山繡線菊，溫度逐漸由15℃降至10℃，再降至5℃時取樣葉片，低溫處理時間持續約3周，處理期間露地自然晝夜平均光照為860-1100μmol·m^-2·s^-1。

3.根據權利要求1所述的分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，其特征在于步驟四中在IPGphor電泳儀上進行等電聚焦時電泳儀的參數設定如下：30v8小時，50v4小時，100v1小時，300v1小時，500v1小時，1000v1小時，8000v12小時。

4.根據權利要求1所述的分離純化谷胱甘肽過氧化物酶的方法，其特征在于步驟五中制備凝膠方法如下：12.5％的500ml體系中依次加入以下藥品：188ml丙烯酰胺單體貯存液、113ml4倍分離膠緩沖液、140mlddH₂O、5ml10％SDS溶液、0.5mlTEMED、4.5ml10％過硫酸銨溶液。