[發明專利]一種利用甘油發酵生產苯酚的工程菌株的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201510577825.4
• 申請日: 2015-09-11
• 公開（公告）號: CN105112351B
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 車程川;王斌;王瑩;袁雪嬌;李敏
• 申請（專利權）人: 曲阜師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 劉麗

本發明涉及工程菌株構建技術領域，特別涉及一種利用甘油發酵生產苯酚的工程菌株的構建方法，在pTrc99a載體中分別插入序列表中序列2、3的堿基序列，得到的重組質粒，將重組質粒電轉化ATCC31884菌株，獲得利用甘油發酵生產苯酚的工程菌株。本發明構建的菌株高效表達酪氨酸苯酚裂解酶和苯丙氨酸4?單加氧酶，所得的大腸桿菌工程菌株利用甘油生產苯酚的含量達到21.30?57.66mg/L，從而實現了生物法發酵甘油生產苯酚，降低了苯酚的生產成本，提高了經濟效益。

技術領域

本發明涉及工程菌株構建技術領域，特別涉及一種利用甘油發酵生產苯酚的工程菌株的構建方法，還涉及得到的工程菌株的應用。

背景技術

苯酚是一種重要的基本有機化工原料，主要用于生產酚醛樹脂、雙酚A和己內酰胺、己二酸、苯胺等；苯酚衍生物如鹵代酚、硝基酚、烷基酚可用于醫藥、染料、香料以及各種添加劑等的生產，因此苯酚市場具有良好的發展前景。

甘油又稱丙三醇，分子式C₃H₅(OH)₃，是一種粘稠液體，有甜味，能與水以任意比混溶，有強烈的吸濕性。甘油資源豐富、價格低廉，由于其C原子的高度還原性，在燃料和化學品生產中具有比普通糖如葡萄糖更高的收益，所以已經成為一個有吸引力的原料。

目前，世界上苯酚的生產方法主要是化學法合成：異丙苯法、甲苯-苯甲酸法、苯直接氧化法、苯硼酸法以及環己酮-環己醇法。其中異丙苯法是目前最主要的苯酚生產方法，生產能力占世界苯酚總生產能力的90％以上。其工藝步驟是：苯和丙烯反應合成異丙苯；異丙苯經氧氣或空氣氧化，生成過氧化氫異丙苯(CHP)；CHP分解生成苯酚和丙酮。副產物丙酮具有毒性，所以化學法合成苯酚存在生產成本高、環境污染大、副產物多等一系列問題。

苯酚的生物合成由于自身毒性對微生物的傷害而受到了限制，因此關于生物法合成苯酚的研究較少。目前，國外已有關于以葡萄糖為原料生產苯酚的報道，根據相關文獻報道(Byoungjin Kim,Hyegwon Park,Dokyun Na,Sang Yup Lee.Metabolic engineering ofEscherichia coli for the production of phenol from glucose.BiotechnolJournal,2014,9,621–629.)，Byoungjin Kim利用葡萄糖生產苯酚的最高效價達到3.79g/L，但是沒有利用甘油發酵生產苯酚的報道。

發明內容

為了解決以上現有技術中化學法生產苯酚存在的生產成本高、環境污染大、副產物多等問題，及生物法合成苯酚的研究較少的現狀，本發明以甘油為原料，研究了一種利用甘油發酵生產苯酚的工程菌株的構建方法。

本發明還提供了所述得到的工程菌株的應用。

本發明是通過以下步驟得到的：

大腸桿菌利用甘油生產苯酚的途徑如圖1所示，其中涉及打通代謝條路的兩個關鍵酶基因為tpl(編碼酪氨酸苯酚裂解酶)和p4m(編碼苯丙氨酸-4-單加氧酶)，酪氨酸苯酚裂解酶催化酪氨酸生成苯酚，苯丙氨酸-4-單加氧酶則催化苯丙氨酸生成酪氨酸。涉及利用甘油生產苯酚的兩個基因為glpX(編碼果糖-1,6-二磷酸酶)和tktA(編碼轉酮醇酶)。果糖-1,6-二磷酸酶催化1,6-二磷酸果糖生成6-磷酸果糖，轉酮醇酶催化6-磷酸果糖生成4-磷酸赤蘚糖。

本發明的第一個目的是提供一種生產苯酚的大腸桿菌工程菌株的構建方法，該菌株共表達酪氨酸苯酚裂解酶(tpl基因編碼)和苯丙氨酸-4-單加氧酶(p4m基因編碼)。

所述酪氨酸苯酚裂解酶的氨基酸序列具體如序列表中的序列1所示，共由456個氨基酸組成；

所述酪氨酸苯酚裂解酶的編碼基因是經過密碼子優化的，其基因序列具體如序列表中的序列2所示，共由1373個核苷酸組成；