[發(fā)明專利]一種利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯酚的工程菌株的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510577825.4
• 申請(qǐng)日: 2015-09-11
• 公開（公告）號(hào): CN105112351B
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 車程川;王斌;王瑩;袁雪嬌;李敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 曲阜師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 劉麗

1.一種工程菌株在利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯酚中的應(yīng)用，其特征在于對(duì)所述工程菌株進(jìn)行種子液培養(yǎng)，然后接種到含有甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

所述工程菌株是通過以下步驟構(gòu)建得到的：

（2）在pTrc99a載體的多克隆位點(diǎn)Kpn I和Pst I之間插入序列表中序列2的堿基序列，同時(shí)在多克隆位點(diǎn)Pst I和Hind III之間插入序列表中序列3的堿基序列后得到的重組質(zhì)粒命名為pTrc99a-tpl-p4m；

（2）將從質(zhì)粒pTrc99a擴(kuò)增的trc啟動(dòng)子插入到序列表中序列4的glpX基因上游，并一起插入到質(zhì)粒pTrc99a的多克隆位點(diǎn) Kpn I和BamH I之間，得到中間質(zhì)粒pTrc99a-trcglpX，將序列表中序列5的tktA基因接入中間質(zhì)粒pTrc99a-trcglpX的多克隆位點(diǎn)BamH I和Xba I之間，得到中間質(zhì)粒pTrc99a-trcglpX-tktA，以重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl-p4m為模板，擴(kuò)增得到tpl-p4m基因，通過BspH I和Sac I酶切位點(diǎn)接入中間質(zhì)粒pTrc99a-trcglpX-tktA，得到重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl-p4m-trcglpX-tktA；

（3）從質(zhì)粒pTrc99a擴(kuò)增trc啟動(dòng)子，在pTrc99a-tpl-p4m-trcglpX-tktA載體的多克隆位點(diǎn)Xho I和Nco I之間插入酶切后的trc啟動(dòng)子后得到重組質(zhì)粒pTrc99a-tpl-trcp4m-trcglpX-tktA，電轉(zhuǎn)化ATCC31884，獲得利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)苯酚的工程菌株；

發(fā)酵培養(yǎng)基中含有甘油 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂0 17.11 g/L，KH₂PO₄ 3 g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.492 g/L，CaCl₂·6H₂O 0.022 g/L，裝液量10mL/20mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于種子液培養(yǎng)為從固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種至試管中培養(yǎng)，裝液量為10mL/20mL，在培養(yǎng)基中添加Amp 100μg/mL，37℃,200r/min培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于種子液培養(yǎng)基中含有蛋白胨 10 g/L，氯化鈉 10 g/L，酵母粉 5 g/L，pH 7.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于固體平板培養(yǎng)基中含有蛋白胨 10 g/L，氯化鈉 10 g/L，酵母粉 5 g/L，瓊脂 15 g/L，pH 7.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)操作為：

將培養(yǎng)好的種子液按10%（v/v）的接種量，接種至裝有10mL發(fā)酵培養(yǎng)基的20mL試管中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加Amp 100μg/mL，37℃,200r/min培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至OD₆₀₀為0.4-0.6時(shí)，添加0.4mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。