[發明專利]小麥3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因TaHMGR及其分離克隆、定點突變及酶功能的檢測方法

有效

• 申請號: 201510577646.0
• 申請日: 2015-09-11
• 公開（公告）號: CN105112430B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 楚秀生;劉洋洋;崔德周;郭棟;樊慶琦;隋新霞;黃承彥
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種參與小麥甲羥戊酸代謝途徑中類異戊二烯物質合成的第一個關鍵酶基因的分離克隆、基因定點突變、酶蛋白的原核表達、酶蛋白的分離純化及酶活性檢測技術，為進一步進行基因改造和修飾、構建3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的真核生物基因表達載體并轉化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業價值的植物，探討3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產物、作物籽粒大小及粒重等重要農藝性狀的關系，進而提高農作物產量，以及對3?羥基?3?甲基戊二酰輔酶A還原酶基因內含子、外顯子及啟動子結構進行剖析，研究啟動子功能、開發有關分子標記提供重要技術儲備。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種參與小麥甲羥戊酸代謝途徑中類異戊二烯物質合成的第一個關鍵酶基因小麥3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因TaHMGR及其分離克隆、定點突變及酶功能的檢測方法。

背景技術

類異戊二烯物質是維持植物生長發育、光合作用、電子傳遞、應對環境脅迫等所必需的重要物質。該類物質可作為光合色素(如葉綠素、類胡蘿卜素)、生長物質和植物激素(如細胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內酯)、膜結構的一部分如谷甾醇、電子傳遞受體如質體醌、作為葡萄糖基化反應中葡萄糖的受體如多萜醇，并能調控細胞的生長(如異戊烯基蛋白，細胞分裂素)。此外，很多植物類異戊二烯還具有重要的商業價值如橡膠、食物香料、飲料、維生素A、D、E以及天然殺蟲劑如除蟲菊素等。

類異戊二烯物質主要通過甲羥戊酸途徑中的一系列酶催化合成的，其中該代謝途徑中第一個關鍵酶是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR；EC 1.1.1.34)，是控制代謝途徑的限速酶之一。該酶利用NADPH，將3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉化成中間代謝產物甲羥戊酸。目前HMGR基因已經從擬南芥、番茄、巴西橡膠樹、長春花、馬鈴薯等80多種植物中分離克隆出來。但是現有技術中還沒有公開或發表過關于從小麥品種“濟麥22”或從其它小麥品種中分離克隆完整3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因、基因定點突變、基因原核表達、酶蛋白的分離純化及其酶功能體外檢測等研究資料信息，因此有必要對其進行深入的研究和開發其相關應用。

發明內容

針對現有技術中的上述情況，本發明的發明人提供了一種參與小麥甲羥戊酸代謝途徑中類異戊二烯物質合成的第一個關鍵酶基因的分離克隆、基因定點突變、酶蛋白的原核表達、酶蛋白的分離純化及酶活性檢測技術。為進一步進行基因改造和修飾、構建3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的真核生物基因表達載體并轉化相應作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業價值的植物，探討3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產物、作物籽粒大小及粒重等重要農藝性狀的關系，進而提高農作物產量，以及對3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因內含子、外顯子及啟動子結構進行剖析，研究啟動子功能、開發有關分子標記提供重要技術儲備，特別是可以通過改變特定氨基酸密碼子來提高或降低酶的催化活性。

本發明從小麥品種“濟麥22”克隆獲得的野生型3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶對底物NADPH和HMG-COA的K_M值分別為41.3±4.2和39.5±4.6mM；Vmax分別為0.08±0.00和0.09±0.00mmol/min/mg；Kcat分別為0.15±0.01和0.16±0.01S^-1；Kcat/K_M分別為3.63×10³和4.05×10³M^-1S^-1，由此證明克隆的野生型小麥3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因具有天然生物學功能。測得了小麥3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的13個突變體對底物NADPH和HMG-COA的酶動力學參數，結果表明，通過對特定氨基酸密碼子的改變，能夠顯著提高或降低酶的催化活性。

本發明提供的小麥3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因TaHMGR，其編碼區核苷酸序列如Seq ID No.1所示，其編碼的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。