[發(fā)明專利]一種RBS優(yōu)化提高α?酮異己酸產(chǎn)量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510575189.1
• 申請日: 2015-09-10
• 公開（公告）號: CN105087457B
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;陳堅;堵國成;李江華;宋陽
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種RBS優(yōu)化提高α-酮異己酸產(chǎn)量的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

α-酮異己酸(KIC)，又稱α-氧代異戊酸，是亮氨酸合成與分解的中間代謝產(chǎn)物，它作為亮氨酸的無氮替代物，能夠作為腎病患者的營養(yǎng)補充劑。除此之外，KIC可以在飼料、保健品、化學(xué)合成領(lǐng)域。

目前KIC的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法，主要包括二乙基草酰胺與格氏試劑加成產(chǎn)物的水解反應(yīng)、雙羰基化法、海因法等等。這些方法反應(yīng)條件苛刻，都需要特殊結(jié)構(gòu)作為起始物，或者價格昂貴的催化劑(如八羥基二鈷與零價鈀的絡(luò)合物)，并且都需要經(jīng)過多步反應(yīng)作為起始物，較難用于生產(chǎn)實踐和工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。微生物轉(zhuǎn)化或者酶轉(zhuǎn)化法，可以替代傳統(tǒng)的化學(xué)合成法來生產(chǎn)α-酮異己酸。目前，可以通過大腸桿菌表達來自Proteus vulgaris的L-氨基酸脫氨酶，實現(xiàn)底物亮氨酸向酮異己酸的高轉(zhuǎn)化高產(chǎn)率的轉(zhuǎn)化過程。

然而，目前的α-酮異己酸在轉(zhuǎn)化過程中的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率還較低，不夠達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，所以需要進一步提高α-酮異己酸的產(chǎn)量。本發(fā)明旨在通過對核糖體結(jié)合位點進行優(yōu)化，提高L-氨基酸脫氨酶的翻譯表達水平，以期進一步提高α-酮異己酸的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種L-氨基酸脫氨酶活力提高的重組大腸桿菌，是將來自普通變形桿菌(P.vulgaris)的編碼L-氨基酸脫氨酶的基因，以pET28a(+)為表達載體進行重組表達，所述載體pET28a(+)的原始RBS序列區(qū)域有一個或者多個堿基發(fā)生突變。

所述載體pET28a(+)的原始RBS序列是302bp-307bp的AAGGAG序列。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變是載體pET28a(+)的原始RBS序列突變?yōu)镃TGCGG、CTACGG、CGGTTA或TATGGT。

本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述重組大腸桿菌的方法，是將來自普通變形桿菌(P.vulgaris)的編碼L-氨基酸脫氨酶的基因，與pET28a(+)連接，得到重組表達載體pET28a-lad，以pET28a-lad為模板，通過PCR擴增的方法，將RBS編碼序列突變后，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌，篩選得到重組菌。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述大腸桿菌是E.coli BL21(DE3)。

本發(fā)明還提供了一種提高α-酮異己酸產(chǎn)量的方法，是利用所述L-氨基酸脫氨酶活力提高的重組大腸桿菌作為全細(xì)胞催化劑，轉(zhuǎn)化底物L(fēng)-亮氨酸得到α-酮異己酸。

在本發(fā)明的一種實施方式中，以含0.8g/L重組大腸桿菌全細(xì)胞、100mM/L底物L(fēng)-亮氨酸的體系，在37℃下轉(zhuǎn)化生成α-酮異己酸，并每隔2h流加100mM L-亮氨酸，共流加6次，共轉(zhuǎn)化反應(yīng)24h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌全細(xì)胞的獲得，是將種子培養(yǎng)液按2％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6，添加終濃度0.4mM的IPTG，37℃誘導(dǎo)5h，收集細(xì)胞。

所述的種子培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基(/L)：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，蒸餾水定容至100mL。發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各組分溶解后高壓滅菌。冷卻到60℃，再加100mL滅菌的17mmol/L KH₂PO₄和72mmol/LK₂HPO₄的溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54g的K₂HPO₄溶于水中，終體積為100mL，高壓滅菌)。

本發(fā)明對表達載體pET28a-lad的RBS序列進行改造，提高酶的翻譯效率、提高酶活，并構(gòu)建了可以高效生產(chǎn)的菌種從而提高α-酮異己酸產(chǎn)量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的α-酮異己酸產(chǎn)量可以達到81.41g/L，底物轉(zhuǎn)化率88.66％。本轉(zhuǎn)化方法反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境污染少，而且底物選擇性高，目的產(chǎn)物專一，反應(yīng)速率快，產(chǎn)物得率高，而且生產(chǎn)周期短，只需24h。此方法有利于解決化學(xué)合成法中的污染嚴(yán)重，步驟繁瑣等問題，而且工藝簡單，易于控制，方便推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1 RBS優(yōu)化的催化活力變化。

圖2 RBS優(yōu)化后的α-酮異己酸產(chǎn)量。

具體實施方式

材料與方法