[發明專利]一種RBS優化提高α?酮異己酸產量的方法

有效

• 申請號: 201510575189.1
• 申請日: 2015-09-10
• 公開（公告）號: CN105087457B
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;堵國成;李江華;宋陽
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 張勇

1.一種L-氨基酸脫氨酶活力提高的重組大腸桿菌，其特征在于，是將來自普通變形桿菌的編碼L-氨基酸脫氨酶的基因，以pET28a(+)為表達載體進行重組表達，所述載體pET28a(+)的原始RBS序列區域有一個或者多個堿基發生突變，所述突變是載體pET28a(+)的原始RBS序列突變為CTACGG、CGGTTA或TATGGT，所述大腸桿菌是E.coliBL21(DE3)。

2.一種構建權利要求1所述重組大腸桿菌的方法，其特征在于，是將來自普通變形桿菌（P. vulgaris）的編碼L-氨基酸脫氨酶的基因，與pET28a(+)連接，得到重組表達載體pET28a-lad，以pET28a-lad為模板，通過PCR擴增的方法，將RBS編碼序列突變后，再轉入大腸桿菌，篩選得到重組菌。

3.一種應用權利要求1所述重組大腸桿菌提高α-酮異己酸產量的方法，其特征在于，將所述重組大腸桿菌作為全細胞催化劑，轉化底物L-亮氨酸得到α-酮異己酸，所述方法具體為：以含0.8 g/L重組大腸桿菌全細胞、100 mM/L底物L-亮氨酸的體系，在37^oC下轉化生成α-酮異己酸，并每隔2 h流加100 mM L-亮氨酸，共流加6次，共轉化反應24 h。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌全細胞的獲得，是將種子培養液按2%的接種量接種到發酵培養基中，37^oC培養至OD₆₀₀為0.6，添加終濃度0.4 mM的IPTG，37^oC誘導5 h，收集細胞。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的發酵培養基每L含有：蛋白胨12 g，酵母提取物24 g，甘油4 mL；各組分溶解后高壓滅菌，冷卻到60^oC，再加100 mL滅菌的17 mmol/L KH₂PO₄和72 mmol/L K₂HPO₄的溶液。