[發明專利]抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體，包含該單克隆抗體的金標試紙條及應用

有效

• 申請號: 201510573865.1
• 申請日: 2015-09-10
• 公開（公告）號: CN105198986B
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 高玉龍;王笑梅;唐宏;王牟平;王曉艷;朱海波;祁小樂;王永強;高宏雷
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.一種用于檢測禽白血病病毒的金標試紙條，其特征在于，含有抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體4A2以及抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體3H11，其中，抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體4A2用于在硝酸纖維素膜上制備檢測線，所述的抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體3H11用于制備金標結合物；所述的抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體4A2由菌種保藏編號為：CGMCC NO.11089的雜交瘤細胞株產生，所述的抗禽白血病病毒p27蛋白單克隆抗體3H11由菌種保藏編號為：CGMCC NO.11090 的雜交瘤細胞株產生。

2.如權利要求1所述的試紙條，其特征在于，按照以下方法制備得到：

(1)膠體金溶液制備

采用檸檬酸鈉還原法制備粒徑為25nm的膠體金顆粒，在攪拌狀態下，100mL0.01％氯金酸水溶液加熱至沸騰，迅速加入1.5mL 1％檸檬酸鈉水溶液，觀察溶液顏色由白色轉變為黑色再變成酒紅色；當溶液的顏色完全變為酒紅色時繼續加熱5min后停止加熱，自然冷卻后于2～8℃下避光保存；

(2)金標結合物的制備

金標結合物標記：向10mL膠體金溶液中逐滴加入0.1M K₂CO₃ 0.1mL，攪拌5min，加入鼠抗禽白血病病毒p27抗原的單克隆抗體3H11 200μL，混勻15min，然后加入終濃度為1％的穩定劑BSA，混勻5min后靜置30min，隨后對金標結合物溶液采用4℃，12,000rpm離心20min，棄上清；

金標結合物純化：將上述標記步驟中的金標結合物沉淀中加入含BSA穩定劑的復溶液至10mL，混勻后再次用4℃，12,000rpm離心20min，棄上清，采用金標結合物復溶液重懸；

金標結合物包被：用金標結合物稀釋液將純化后的金標結合物稀釋到合適濃度后，采用三維噴點儀將其噴涂至金標結合墊上，濕度<30％的條件下，室溫干燥12h以上；

(3)硝酸纖維素反應膜的包被

取1mg/ml的鼠抗禽白血病病毒p27抗原的單克隆抗體4A2和0.2mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗體，分別在硝酸纖維素膜上制備檢測線和質控線，濕度<30％的條件下，室溫干燥12h；

(4)大板粘貼、切割

啟動干燥間干燥設備，待環境濕度小于30％時，取步驟(3)中制備的硝酸纖維素反應膜，首先撕去膜下方的油光紙，將步驟(2)中制備的金標結合物反應墊貼于NC膜的下方，兩者重疊1～2mm；再將樣品墊粘貼到金標墊的下方，兩者重疊1～2mm，且樣品墊的下邊緣與PVC底板的下邊緣對齊；最后撕去NC膜上方的油光紙，在NC膜的上方粘貼吸水墊，兩者重疊1～2mm，且吸水墊的上邊緣與PVC底板的上邊緣對齊；最后用撕下來的油光紙從左至右輕輕履平粘貼的金標結合墊、樣品墊和吸水紙；將組裝好的大板放在切條機上，卡好位置，確保放正，設置寬度3.94mm/條，啟動切條，將切好的試紙條置于試紙卡下蓋的凹槽中，蓋上上蓋，保證加樣孔位于樣品墊一方，置于壓殼機上，壓實。