[發明專利]基于氣相色譜-質譜聯用技術和形態的山羊轉基因克隆胚胎質量評估差異代謝物的篩選方法

在審

• 申請號: 201510571809.4
• 申請日: 2015-09-09
• 公開（公告）號: CN105112491A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: 張艷麗;張國敏;萬永杰;王鋒
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/073;G01N30/02
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種基于氣相色譜-質譜聯用技術和形態的山羊轉基因克隆胚胎質量評估差異代謝物的篩選方法。

背景技術

體細胞核移植技術(SCNT)能將體細胞在體外去分化，發育成具有全能性的胚胎，這在臨床上有廣闊的應用前景。然而，SCNT技術過程復雜、影響因素多，通過SCNT技術獲得出生個體的效率也非常低，嚴重制約轉基因大家畜的研究與應用。研究發現，缺乏有效的胚胎評估體系，不能篩選出優質的移植胚胎是影響SCNT效率低下的主要原因之一。因此，尋找一種更為客觀、全面的評估胚胎質量和發育潛能的方法，篩選優質胚胎進行移植至關重要。

目前，胚胎評估最主要的方法是形態學觀察，依據卵裂球形態、數目及分布、胚胎色澤和細胞碎片等參數評估胚胎質量。雖然這種方法直觀快速，但缺乏統一標準，觀察者的主觀性使胚胎形態與發育潛能的評估出現偏差。另外，有胚胎碎片的胚胎可能有更好的發育潛能，并且形態正常的胚胎也可能存在遺傳或表觀遺傳缺陷。因此，僅僅通過形態學不足以識別優質胚胎。因此如何有效篩選出優質的移植胚胎和提高轉基因克隆的效率是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

發明內容

本發明的目的在于一種基于氣相色譜-質譜聯用技術和形態的山羊轉基因克隆胚胎質量評估差異代謝物的篩選方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種基于氣相色譜-質譜聯用技術和形態的山羊轉基因克隆胚胎質量評估差異代謝物的篩選方法，包括以下步驟：

(1)重構胚培養48h時，檢查卵裂率，并依據形態將卵裂的胚胎分為高質量卵裂胚胎組和低質量卵裂胚胎組，隨機將各組胚胎分組放入囊胚培養滴中繼續培養；

(2)第7.5d統計囊胚率并分別收集高質量卵裂胚胎組和低質量卵裂胚胎組的囊胚和胚胎代謝液；

(3)對收集的胚胎代謝液樣品進行處理，并以囊胚培養液作為空白對照進行氣相色譜-質譜檢測；

(4)對檢測結果進行統計分析：用SIMCA-P11.5軟件進行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析胚胎代謝液的代謝組學測定結果，應用OPLS-DA模型中VIP值(VIP>1)以及t檢驗中的P值(P<0.05)來確定組間差異代謝物。

步驟(1)中根據重構胚培養48h后卵裂球數目、大小均一性和細胞碎片多少將胚胎分為高質量卵裂胚胎組和低質量卵裂胚胎組；所述的高質量卵裂胚胎組卵裂球細胞數目≥8細胞，形態大小一致，胞質碎片<10％；所述的低質量卵裂胚胎組卵裂球細胞數目≥8細胞，形態大小不均勻，胞質碎片≥10％。

步驟(3)中胚胎代謝液樣品進行處理的過程為：向胚胎代謝液樣品中加入甲醇和L-2-氯苯丙氨酸，混勻后離心取上清液進行真空濃縮干燥，然后加入甲氧胺鹽試劑(20mg/mL甲氧胺鹽酸鹽溶液)并混勻在37℃條件下孵育2h，最后加入BSTFA試劑(內含有1％(v/v)TCMS)充分混勻后在70℃條件下孵育1h；冷卻至室溫(25±5℃)。

所述胚胎代謝液樣品、甲醇、L-2-氯苯丙氨酸的體積比為1：3.5：0.5。

所述胚胎代謝液樣品、甲氧胺鹽試劑、BSTFA試劑的體積比為1：0.8：1。

所述離心的條件為4℃、12000rpm離心10min。

步驟(3)中氣相色譜-質譜檢測的條件：色譜柱：DB-5MS毛細管柱；運載氣體：氦氣；進氣速度：3mL/min；通過毛細管柱的速度：1mL/min；升溫程序：80℃保持0.2min；然后以10℃/min的速度上升至180℃；接著以5℃/min的速度上升至240℃；再以20℃/min的速度上升至290℃；最后在290℃保持11min；電子轟擊離子源(EI)；離子化電壓為70eV；接口溫度、傳輸流和離子源的溫度分別為280℃、270℃和220℃；樣品保留492s后，在35～600m/z的范圍內，以100光譜/min的速率獲得質譜數據。

胚胎質量對于胚胎移植的成功與否至關重要，篩選出能評價胚胎質量的代謝標記物對提高轉基因克隆的效率有重要意義。本試驗根據不同的形態標準(高質量：Avs低質量：B)對山羊轉基因克隆胚胎進行分組培養，體外發育至囊胚時，收集各組的囊胚和對應的胚胎代謝液進行分析。結果發現，高質量胚胎組A組的囊胚率顯著高于低質量胚胎組B組(P<0.05)。應用氣相色譜-質譜聯用技術測定各組胚胎代謝液后，經PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析發現，組間代謝液中含有多種顯著差異代謝物，這些差異物與胚胎的質量密切相關。