[發明專利]基于氣相色譜-質譜聯用技術和形態的山羊轉基因克隆胚胎質量評估差異代謝物的篩選方法

在審

• 申請號: 201510571809.4
• 申請日: 2015-09-09
• 公開（公告）號: CN105112491A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發明（設計）人: 張艷麗;張國敏;萬永杰;王鋒
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/073;G01N30/02
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種基于氣相色譜-質譜聯用技術和形態的山羊轉基因克隆胚胎質量評估差異代謝物的篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)重構胚培養48h時，檢查卵裂率，并依據形態將卵裂的胚胎分為高質量卵裂胚胎組和低質量卵裂胚胎組，隨機將各組胚胎分組放入囊胚培養滴中繼續培養；

(2)第7.5d統計囊胚率并分別收集高質量卵裂胚胎組和低質量卵裂胚胎組的囊胚和胚胎代謝液；

(3)對收集的胚胎代謝液樣品進行處理，并以囊胚培養液作為空白對照進行氣相色譜-質譜檢測；

(4)對檢測結果進行統計分析：用SIMCA-P11.5軟件進行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析胚胎代謝液的代謝組學測定結果，應用OPLS-DA模型中VIP值(VIP>1)以及t檢驗中的P值(P<0.05)來確定組間差異代謝物。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中根據重構胚培養48h后卵裂球數目、大小均一性和細胞碎片多少將胚胎分為高質量卵裂胚胎組和低質量卵裂胚胎組；所述的高質量卵裂胚胎組卵裂球細胞數目≥8細胞，形態大小一致，胞質碎片<10％；所述的低質量卵裂胚胎組卵裂球細胞數目≥8細胞，形態大小不均勻，胞質碎片≥10％。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中胚胎代謝液樣品進行處理的過程為：向胚胎代謝液樣品中加入甲醇和L-2-氯苯丙氨酸，混勻后離心取上清液進行真空濃縮干燥，然后加入甲氧胺鹽試劑并混勻在37℃條件下孵育2h，最后加入BSTFA試劑充分混勻后在70℃條件下孵育1h；冷卻至室溫。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述胚胎代謝液樣品、甲醇、L-2-氯苯丙氨酸的體積比為1：3.5：0.5。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述胚胎代謝液樣品、甲氧胺鹽試劑、BSTFA試劑的體積比為1：0.8：1。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述離心的條件為4℃、12000rpm離心10min。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中氣相色譜-質譜檢測的條件：色譜柱：DB-5MS毛細管柱；運載氣體：氦氣；進氣速度：3mL/min；通過毛細管柱的速度：1mL/min；升溫程序：80℃保持0.2min；然后以10℃/min的速度上升至180℃；接著以5℃/min的速度上升至240℃；再以20℃/min的速度上升至290℃；最后在290℃保持11min；電子轟擊離子源(EI)；離子化電壓為70eV；接口溫度、傳輸流和離子源的溫度分別為280℃、270℃和220℃；樣品保留492s后，在35～600m/z的范圍內，以100光譜/min的速率獲得質譜數據。