[發(fā)明專利]多功能的經血干細胞培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510566727.0
• 申請日: 2015-09-08
• 公開（公告）號: CN105112358B
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發(fā)明（設計）人: 王泰華
• 申請（專利權）人: 東莞賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

一種多功能的經血干細胞培養(yǎng)方法，通過經血和血漿的采集階段、經血的除菌清洗階段、經血的過濾階段、自體血漿的制備階段、單個核細胞的分離階段、經血干細胞的培養(yǎng)階段、經血干細胞的純化及擴增階段和經血干細胞的凍存階段，由此本發(fā)明一是解決了現有技術必須用高濃度的胎牛血清培養(yǎng)帶來的各種弊端，二是用客戶自己的血漿培養(yǎng)自己的細胞，更讓其自身覺得安全且易接受，真正實現了一種安全、穩(wěn)定、快速、高質量擴增間充質干細胞的培養(yǎng)體系。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種多功能的經血干細胞培養(yǎng)方法，特別涉及一種從經血中提取并培養(yǎng)經血干細胞的方法。

背景技術

近眾所周知，子宮內膜細胞系具有很強的自我更生能力，在每個月經周期都會有組織和血管的大量增長，這一增長過程會隨著月經的來臨而終止繼而形成經血。經血是女性血液和一些脫落的子宮內膜、子宮頸粘液及陰道分泌物的混雜液體。近年來，美國的研究小組和日本的研究小組利用女性經血成功分離培養(yǎng)出具有多向分化功能的干細胞，并將該細胞命名為子宮內膜經血源間充質干細胞其，簡稱經血干細胞，其擴增能力是自體骨髓干細胞的30倍，而且在神經修復、抑制腫瘤和美容抗衰老等方面具有非常顯著的作用，因此有望用來治療損傷和衰老的組織。同時經血的獲得不具有侵入性不會對供者造成傷害,不僅來源廣泛，且對其研究不會涉及倫理道德和法律問題。此外，經血干細胞還具有采集方便、易于體外培養(yǎng)、擴增和誘導等特性，被認為是干細胞研究的一種理想種子細胞，因此成為尋找人類干細胞新來源及提高臨床應用效果的研究熱點。

由于子經血干細胞研究是近幾年才開始，與之配套的培養(yǎng)體系還不成熟，目前體外擴增培養(yǎng)體系中一般都含有一定濃度的胎牛血清，使用濃度至少10％才能保證細胞的正常生長傳代。然而，經血干細胞在高濃度血清培養(yǎng)時，隨著傳代次數增加，細胞增殖能力下降，形態(tài)由長梭形變?yōu)閷挻蟊馄剑饾u喪失多向分化能力。另外，動物血清可能存在動物攜帶的潛在病毒或支原體污染，對以后可能的臨床應用構成威脅。盡管有些研究人員嘗試了一些無血清培養(yǎng)基方案，但經血干細胞在無血清培養(yǎng)基中普遍存在生長緩慢，多向分化能力逐漸消失的問題，所以，急需開發(fā)一種安全、穩(wěn)定、快速、高質量擴增間充質干細胞的培養(yǎng)體系。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的提供一種多功能的經血干細胞培養(yǎng)方法，通過經血和血漿的采集階段、經血的除菌清洗階段、經血的過濾階段、自體血漿的制備階段、單個核細胞的分離階段、經血干細胞的培養(yǎng)階段、經血干細胞的純化及擴增階段和經血干細胞的凍存階段，由此本發(fā)明一是解決了現有技術必須用高濃度的胎牛血清培養(yǎng)帶來的各種弊端，二是用客戶自己的血漿培養(yǎng)自己的細胞，更讓其自身覺得安全且易接受，真正實現了一種安全、穩(wěn)定、快速、高質量擴增間充質干細胞的培養(yǎng)體系。

為了克服現有技術中的不足，本發(fā)明提供了一種多功能的經血干細胞培養(yǎng)方法的解決方案，具體如下：

一種多功能的經血干細胞培養(yǎng)方法，步驟如下：

步驟1：經血和血漿的采集階段，該階段具體為：采用經血采集器采集經血，并將經血迅速轉移到裝有保存液的無菌離心管中，在溫度為4℃的條件下保存，空腹抽取20-30ml靜脈血置入抗凝容器里，在溫度為4℃的條件下保存72h后，以此用于自體血漿的制備；

步驟2：經血的除菌清洗階段，該階段具體為：在48h內將浸泡在經血保存液中的經血運至實驗室，將經血和保存液充分混勻，首次離心為800-1000g/10-15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混勻，再次離心為300-700g/10-15min，除去上清；

步驟3：經血的過濾階段，該階段具體為：將經過步驟2后所得的經血用清洗液1:1混合，充分混勻后用100μm細胞濾網進行過濾，以去除大部分粘液及凝塊；

步驟4：自體血漿的制備階段，該階段具體為：將步驟1中所抽取的靜脈血200g-400g/min離心8～12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血漿，將所述富含血小板的血漿在溫度為2～8℃的條件下保存1～7天備用或在溫度為-75～-85℃的條件下長期保存?zhèn)溆茫?/p>