[發明專利]多功能的經血干細胞培養方法

有效

• 申請號: 201510566727.0
• 申請日: 2015-09-08
• 公開（公告）號: CN105112358B
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 王泰華
• 申請（專利權）人: 東莞賽爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 張仲波

1.一種多功能的經血干細胞培養方法，其特征在于，步驟如下：

步驟1：經血和血漿的采集階段，該階段具體為：采用經血采集器采集經血，并將經血迅速轉移到裝有保存液的無菌離心管中，在溫度為4℃的條件下保存，空腹抽取20-30ml靜脈血置入抗凝容器里，在溫度為4℃的條件下保存72h后，以此用于自體血漿的制備；

步驟2：經血的除菌清洗階段，該階段具體為：在48h內將浸泡在經血保存液中的經血運至實驗室，將經血和保存液充分混勻，首次離心為800-1000g/10-15min，除去上清，再次加入清洗液，充分混勻，再次離心為300-700g/10-15min，除去上清；

步驟3：經血的過濾階段，該階段具體為：將經過步驟2后所得的經血用清洗液1:1混合，充分混勻后用100μm細胞濾網進行過濾，以去除大部分粘液及凝塊；

步驟4：自體血漿的制備階段，該階段具體為：將步驟1中所抽取的靜脈血200-400g/min離心8～12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血漿，將所述富含血小板的血漿在溫度為2～8℃的條件下保存1～7天備用或在溫度為-75～-85℃的條件下長期保存備用；

步驟5：單個核細胞的分離階段，該階段具體為：將步驟3中稀釋的經血加入人淋巴細胞分離液之上，在溫度為18-25℃的條件下700-1000g離心15-20分鐘；吸取中央白膜層細胞即單個核細胞，將單個核細胞吸至另一潔凈離心管中，加入PBS重復離心洗滌2-3次；收集底部單個核細胞沉淀；

步驟6：經血干細胞的培養階段，該階段具體為：用完全培養基重懸上述單個核細胞并計數，以1×10⁶細胞/ml的密度接種至T75(75cm²)培養瓶中，置于溫度為37℃、飽和濕度、體積分數為5％的CO₂培養箱中進行培養，以獲取經血干細胞；

步驟7：經血干細胞的純化及擴增階段，該階段具體為：貼壁培養所述單個核細胞，在細胞培養48-72h后更換完全培養基以棄除未貼壁細胞，初次換液后每天觀察細胞的生長情況，每2-3天半量換液一次；

步驟8：經血干細胞的凍存階段，該階段具體為：當擴增的經血干細胞數量達到1-2×10⁸細胞時，按每10⁶-10⁷細胞加入0.5-1ml凍存液，放入凍存盒采用程序降溫，4℃1-2h，-20℃1-2h，轉入-80℃冰箱，12～24h后轉入-196℃液氮保存備用；

其中所述的步驟1和步驟2中的保存液為0.9％生理鹽水或者PBS，加入相應的抗生素和抗凝劑，抗生素濃度為終濃度為0.5-3％的青霉素和鏈霉素、終濃度為1-10ug/ml的兩性霉素B和肝素；

其中，所述的步驟2和步驟3中的清洗液為生理鹽水或者PBS，加入相應青霉素、鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素，其中青霉素和鏈霉素為0.5-3％的終濃度，兩性霉素B為1-10ug/ml的終濃度，慶大霉素為100-200U/ml的終濃度；

其中，所述的步驟6和步驟7中的完全培養基為基礎培養基α-MEM，含有5％的富含血小板的血漿、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、80U/ml慶大霉素；

其中，所述步驟8中的凍存液由80％基礎培養基α-MEM，9％自體血漿，1％的氨基酸，10％的二甲基亞砜組成。