[發(fā)明專利]一種脂肪酶的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510565746.1
• 申請(qǐng)日: 2015-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN105112387A
• 公開（公告）日: 2015-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧永平;艾瑞波;劉曉蘭;鄭喜群
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊齊哈爾大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及好食脈孢霉液體發(fā)酵制備脂肪酶的方法和純化方法。

背景技術(shù)

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）又稱為三酰基甘油酯水解酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外，還表現(xiàn)出如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶催化反應(yīng)具有立體選擇性、底物專一性、副反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和、不需輔酶及可用于有機(jī)溶劑等特點(diǎn)，在食品、皮革、生物柴油、醫(yī)療醫(yī)藥和洗滌劑等多個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域都有應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的脂肪酶酶制劑種類主要有Novozyme435Lipase、LipaseTLIM、LipozymeRMIM、LipaseAYS、LipaseAY-30G、LipaseAY、LipaseAK等，這些市售的酶制劑價(jià)格較貴，難以開展大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，所以，新型、質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的脂肪酶的開發(fā)一直以來備受研究者關(guān)注。

脈孢菌屬（Neurospora）隸屬于真菌界（Fungi），子囊菌門（Ascomycota），核菌綱(Pyrenomycetes)，球殼目（Sphaeriales）。FDA組織認(rèn)為脈孢菌是少數(shù)幾種可食用的安全生物，是對(duì)醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境很重要的一類生物，同時(shí)也是遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究中非常重要的模式生物。利用好食脈孢霉生產(chǎn)脂肪酶具有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明目的之一在于提供一種好食脈孢霉液體發(fā)酵制備脂肪酶的發(fā)酵方法。該方法所產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)量高、活性高，是一種胞外酶，有利于后續(xù)的純化，而且安全性良好，制備成本比較低廉。

本發(fā)明的發(fā)明目的之二在于提供一種脂肪酶的純化方法。該純化方法操作步驟簡(jiǎn)單，回收率較高。

本發(fā)明所使用的菌種為好食脈孢霉（N.sitophila）菌株17號(hào)，保藏號(hào)為CGMCCNo.1836。該菌株是本申請(qǐng)人于1999年3月在中國(guó)北方醬類食品發(fā)酵中間產(chǎn)物醬塊中分離、篩選得到的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1、以好食脈孢霉（N.sitophila）菌株17號(hào)為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)脂肪酶；

2、培養(yǎng)方法：斜面培養(yǎng)→液體種子培養(yǎng)→液體發(fā)酵培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA斜面），培養(yǎng)基含煮沸馬鈴薯汁20%W/V、葡萄糖2%W/V、瓊脂2%W/V，pH自然，121℃滅菌30min，冷卻接種后在28～30℃條件下培養(yǎng)3～5天。

種子培養(yǎng)基制作方法：將30g～50g麩皮加入到1000mL自來水中，浸泡過夜后過濾，留濾液，向?yàn)V液中添加1.5～3%W/V的蛋白胨，加熱充分溶解后，調(diào)節(jié)pH至5.0即制得種子培養(yǎng)基。250mL三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，121℃滅菌30min后冷卻，每瓶培養(yǎng)基接入10⁵～10⁶個(gè)孢子后在28～30℃、150r/min條件下培養(yǎng)48小時(shí)。

發(fā)酵培養(yǎng)基含10%W/V麩皮、6%W/V玉米黃粉，0.1%V/V的吐溫-80，0.01%W/VKCl，培養(yǎng)基初始pH5.5～6.5，250mL三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，121℃滅菌30min后冷卻，接入1%V/V的液體種子，在28～33℃培養(yǎng)48小時(shí)，經(jīng)過離心得到上清液，上清液中脂肪酶活力為303.83U/mL。

、粗提純纖溶酶：經(jīng)過30%W/V飽和度硫酸銨鹽析，4℃環(huán)境中靜置過夜，再經(jīng)10000r/min冷凍離心20min除去固形物，得到的上清液即為含脂肪酶的粗酶液。

、精提純纖溶酶

采用色譜技術(shù)對(duì)粗酶液進(jìn)行精提純，依次采用以下方法純化得到高純度的脂肪酶：

A、Octyl-SepharoseFF疏水相互作用色譜

將粗酶液中的硫酸銨飽和度調(diào)到30%W/V，平衡液為含30%W/V飽和度硫酸銨的0.02mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7.0。上樣后用含30%～0W/V硫酸銨飽和度的緩沖液梯度洗脫，收集有脂肪酶活性組分；

B、Superdex75凝膠過濾色譜