[發(fā)明專利]一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體R485P及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510560217.2
• 申請(qǐng)日: 2015-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN105132388B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐國(guó)強(qiáng);蔣伶活;吳滿珍;李鵬越
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12N15/52;C12N1/19;C12P7/46;C12R1/865
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體R485P及其應(yīng)用，屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為一種真核模式微生物，因具有：遺傳信息豐富，代謝改造操作方便；營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，分離提取工藝成本低廉；在低pH條件下(甚至pH<3.0)生長(zhǎng)良好；能夠耐受高濃度的底物；被FDA認(rèn)證為GRAS(General Regarded As Safe)微生物，發(fā)酵產(chǎn)品具有安全性等優(yōu)點(diǎn)而成為發(fā)酵生產(chǎn)羧酸(乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等)的潛在最適微生物。然而，釀酒酵母在高濃度糖及通風(fēng)的條件下分批發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的乙醇，對(duì)于以羧酸為目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵來(lái)說(shuō)，乙醇的大量積累使得碳流大量的損失。通過(guò)弱化乙醇途徑中的關(guān)鍵酶的活性，可以減少通往乙醇的碳代謝流，從而減少碳流的損失；在此基礎(chǔ)上，可通過(guò)阻止或弱化目標(biāo)羧酸的進(jìn)一步代謝，來(lái)構(gòu)建目標(biāo)羧酸的合成途徑。

丙酮酸羧化酶的作用是將丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，進(jìn)而可將碳流引入到目標(biāo)羧酸的合成途徑，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地描述為“生物閥門”，如何強(qiáng)化丙酮酸羧化反應(yīng)，將碳流更有效地引入到目標(biāo)羧酸的合成途徑，成為代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)羧酸的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。已有研究表明細(xì)胞中丙酮酸羧化酶活性的高低對(duì)蘋果酸、琥珀酸、谷氨酸的積累有著重要作用。任何以二元羧酸為目標(biāo)產(chǎn)物的釀酒酵母發(fā)酵工藝，都將面臨同樣一個(gè)問(wèn)題：如何強(qiáng)化丙酮酸羧化反應(yīng)，促進(jìn)碳流由丙酮酸流向目標(biāo)羧酸的合成途徑？如何提高丙酮酸羧化酶的活性？本發(fā)明所提供的方案，對(duì)于利用釀酒酵母生產(chǎn)羧酸的研究具有普遍的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種丙酮酸羧化酶突變體，所述突變體是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的親本米根霉丙酮酸羧化酶的基礎(chǔ)上，將第485位的精氨酸突變成為脯氨酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述親本米根霉丙酮酸羧化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述突變體的基因工程菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌是以釀酒酵母為宿主。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌是以同時(shí)缺失了丙酮酸脫羧酶PDC1、乙醇脫氫酶ADH1、延胡索酸酶FUM1的釀酒酵母為宿主。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述丙酮酸脫羧酶基因PDC1的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脫氫酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示，延胡索酸酶基因FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用表達(dá)所述突變體的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)二元羧酸的方法。所述二元羧酸，包括延胡索酸、蘋果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述二元羧酸是延胡索酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中添加生物素。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中添加32μg/L生物素。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶突變體的三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1的種子液，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，與28-32℃、150-250rpm條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將30℃、220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以5％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基于30℃、220rpm條件下培養(yǎng)96h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基含有：無(wú)氨基酵母氮源3.4g/L、硫酸銨5g/L、葡萄糖40g/L，亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，碳酸鈣5g/L。

本發(fā)明還涉及所述突變體以及所述突變體得到的延胡索酸在食品、飼料、化工、藥物制備等方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的突變體命名：是以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列為基準(zhǔn)，采用“原始氨基酸、氨基酸位點(diǎn)、替換的氨基酸”來(lái)表示突變體。比如R485P代表將位置485的氨基酸由親本的精氨酸(Arginine，R)替換為脯氨酸(Pro,P)。