[發明專利]生產洛伐他汀及莫納可林J的基因工程菌的構建與應用

有效

• 申請號: 201510552643.1
• 申請日: 2015-09-01
• 公開（公告）號: CN106701857B
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發明（設計）人: 蔡孟浩;劉一奇;張元興
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及生產洛伐他汀及莫納可林J的基因工程菌的構建與應用。通過基因重組技術在酵母工程菌中引入了一系列外源基因，獲得可生產洛伐他汀或其中間產物的酵母工程菌。所述酵母工程菌具有代謝背景低、異源表達能力強，可全細胞合成終產物以及終產物易分離且副產物少等特征，為工業化生產他汀類藥物提供了新思路。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及生產洛伐他汀及莫納可林J的基因工程菌的構建與應用。

背景技術

心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類健康的疾病，其發病率和死亡率在許多國家和地區均排名第一，防止心腦血管疾病的一種有效途徑是抑制肝臟膽固醇的過多合成。在膽固醇生物合成途徑中，3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A(HMG-CoA)還原酶是控制膽固醇合成速度的關鍵酶，催化由HMG-CoA向甲羥戊酸的轉化。因此抑制HMG-CoA還原酶的活性能達到減少或阻斷膽固醇的體內合成的目的，從而防治高血脂病。

他汀類藥物通過抑制3-羥基-3-甲基戊二?；?輔酶A(HMG-CoA)還原酶來發揮作用，而該還原酶是細胞中催化膽固醇生物合成的限制性步驟。洛伐他汀(Lavostatin)和辛伐他汀(Simvastatin)是最常見的降低膽固醇藥物，可以有效降低原發性高脂血癥患者的TC和LDL-C，預防心臟病復發和動脈粥樣硬化的發展，降低心肌血管再形成和非致死心肌梗死手術的危險。

洛伐他汀主要用土曲霉(Aspergillus terreus)或紅曲霉(Monascus rubber)經深層發酵制取，而辛伐他汀是非天然產物，其合成主要包括化學合成法和生物合成法，化學合成法包括間接甲基化(側鏈合成法)和直接甲基化；生物合成法，是莫納可林J(MonacolinJ)與側鏈2，2-二甲基丁酞氯合成法。間接甲基化合成法和生物合成法都需要藥物中間體莫納可林J作為合成底物。

而莫納可林J的合成包括生物發酵法和化學水解法。生物發酵法，是通過分子手段中斷土曲霉(Aspergillus terreus)中的洛伐他汀生物合成途徑，突變后的土曲霉菌株在發酵過程中積累中間產物代謝物莫納可林J，經提取、分離和純化后得到莫納可林J。化學水解法，是經脫酯化、羥基保護、重新酯化、脫保護四個化學反應步驟將天然產物洛伐他汀經水解得到莫納可林J。

上述方法中，生產菌土曲霉(Aspergillus terreus)的次級代謝產物背景多，目標代謝產物得量低、純化復雜，生產成本高昂；而化學合成法中，路線步驟多、生產時間長、底物轉化率低，且在脫酯化反應中的副產物較多，總產率也很低。

因此，還需要進一步地研究和開發洛伐他汀或其中間產物的其它生產方法，以期簡化生產工藝，降低生產成本。

發明內容

本發明的目的在于提供生產洛伐他汀及莫納可林J的基因工程菌的構建與應用。

在本發明的第一方面，提供一種生產洛伐他汀的方法，所述方法包括：

(1)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中轉化有外源的下組基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD，LovF；和

(2)培養(1)的酵母工程菌，從而生成洛伐他汀產物。

在本發明的另一方面，提供一種生產洛伐他汀中間體莫納可林J的方法，所述方法包括：

(a)提供酵母工程菌，所述酵母工程菌中轉化有外源的下組基因的表達盒：LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA；和

(b)培養(a)的酵母工程菌，從而生成莫納可林J產物。

在一個優選例中，所述的LovB，LovC，LovG，LovA，NpgA，LovD或LovF基因來源于土曲霉。