[發(fā)明專(zhuān)利]紅棗中鏈格孢菌的多重PCR檢測(cè)引物及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510545751.6
• 申請(qǐng)日: 2015-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105039573A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝莉花;王勇;吳曉宗;董彩文;丁太春;殷柯柯;縱偉;劉燕;周博
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 張真真;鄭園

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明具體涉及紅棗中鏈格孢菌的多重PCR快速檢測(cè)方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

棗(ZizyphusjujubaMill)屬鼠李科棗屬植物，是一種藥食同源的食品。但紅棗在自然條件下貯藏容易發(fā)生真菌病害侵染引起的霉變，在霉變過(guò)程中，真菌產(chǎn)生的真菌毒素具有很強(qiáng)的毒性，會(huì)給食用者帶來(lái)危害，鏈格孢菌是紅棗霉變中的主要真菌之一，因此，對(duì)其進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)控制紅棗產(chǎn)品的安全性具有重要意義。

傳統(tǒng)的，鏈格孢菌常用分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，分別采用不同的檢驗(yàn)程序、方法，分別報(bào)告，確診檢驗(yàn)結(jié)果至少需5～7d，檢驗(yàn)方法繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)、特異性低等，因此，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的鏈格孢菌檢測(cè)方法將是發(fā)展的方向。建立一種快速檢測(cè)霉變紅棗中鏈格孢菌的檢測(cè)方法具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是采用棗中鏈格孢菌特菌Alt-F1、R1擴(kuò)增片段和Alt-F2，R2擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)引物，采用多重PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在為棗產(chǎn)品的檢測(cè)鏈格孢菌檢測(cè)提供一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便新方法

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種棗中鏈格孢菌特菌多重PCR檢測(cè)方法，采取如下步驟：

(1)將霉變紅棗上刮下的菌絲刮下、洗滌干燥，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板；

(2)從紅棗真菌菌絲中提取基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板，分別用Alt-F1、R1擴(kuò)增片段和Alt-F2，R2擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為50μL：DNA模板2μL；10×緩沖液5μL；dNTP(每種2.5mmol/L)2μL；引物(10μM/L)各2μL；TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL；無(wú)菌水補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸40sec，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取5μLPCR產(chǎn)物加1μL6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在2％瓊脂糖凝膠上110V電泳35min。根據(jù)條帶有無(wú)和大小判定結(jié)果。本發(fā)明的有益效果是：鏈格孢菌是影響紅棗霉變的重要因素，霉變紅棗對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成危害，而傳統(tǒng)的鏈格孢菌細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)、生化鑒定等檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)(需4～7d)，操作繁瑣復(fù)雜，特異性、敏感度低，不能起到有效地監(jiān)測(cè)和預(yù)防作用。本發(fā)明提供的多重PCR檢測(cè)方法可以彌補(bǔ)以上不足，提供一種鏈格孢菌快速高效的檢測(cè)方法。多重PCR擴(kuò)增結(jié)果表明：采用本發(fā)明特異引物檢測(cè)的方法靈敏度高和特異性好，為紅棗霉變的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和快速診斷提供了有效手段，可以推廣應(yīng)用于果蔬加工、食品安全等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為Alt-F1，R1引物特異性，M：DL1000DNAMarker；1：XZJ1；2：XZJ2；3：擴(kuò)展青霉；4：皮落青霉；5：根霉；6：毛霉；7：黑曲霉；8：鏈孢霉；9：長(zhǎng)梗木霉；

圖2為Alt-F2，R2引物特異性，M：DL1000DNAMarker；1：XZJ1；2：XZJ2；3：擴(kuò)展青霉；4：皮落青霉；5：根霉；6：毛霉；7：黑曲霉；8：鏈孢霉；9：長(zhǎng)梗木霉。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種鏈格孢霉多重PCR快速檢測(cè)方法，采用多重PCR技術(shù)一次性擴(kuò)增沙門(mén)菌和大腸桿菌O78的特異基因以及細(xì)菌16srDNA的部分序列，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

本實(shí)施例所用主要試劑：

Tap酶、dNTP：均購(gòu)自TaKaRa公司。真菌DNA提取試劑盒，Omega公司。

本實(shí)施例所用主要儀器：

5311型PCR儀，德國(guó)eppendorf公司；

DYCP-31DN水平電泳儀(北京六一儀器廠)；

Tanon-2500R全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

上述鏈格孢霉多重PCR快速檢測(cè)方法具體包括以下步驟：

(1)合成引物

根據(jù)鏈格孢霉特異基因設(shè)計(jì)特異引物Alt-F1/Alt-R1，上述引物的核苷酸序列為：

Alt-F15-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3

Alt-R15-CGACTTGTGCTGCGCTC-3

(2)將霉變紅棗上刮下的菌絲刮下、洗滌干燥，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板；

(3)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立