[發明專利]一種結縷草的高效農桿菌轉基因方法

在審

• 申請號: 201510542670.0
• 申請日: 2015-08-31
• 公開（公告）號: CN105039393A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 王迅;馬嘯;汪志輝;張新全;付剛;賴云松;梁東;林立金;唐懿;夏惠
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 王震秀

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種結縷草的高效農桿菌轉基因方法。

背景技術

自將外源DNA導入植物細胞后,植物基因工程得到迅速發展。將外源DNA導入植物成功與否與植物種類與基因導入技術等有關系。結縷草的遺傳轉化方法可分為原生質體轉化法和不依賴于原生質體的轉化。

由于原生質體培養操作復雜,且常常難以再生植株,該途徑后來逐漸被人們放棄。不依賴原生質體的轉化法主要有基因槍轉化法和農桿菌介導轉化法。

然而，目前對于結縷草的轉化，仍存在操作復雜、需進行長時間體外培養和轉化率低的問題。如利用懸浮細胞作為受體時，需對細胞進行長時間和專業的培養，且轉化率并不盡人意；利用胚性愈傷組織作為外植體時，需要長時間的培養和對愈傷組織的選別工作，整個轉基因過程長達3個月以上。

結縷草雖然因其具有耐踐踏和耐干旱等優點，但也有不耐溫、不耐寒等缺點，對其進行優良品種的選育工作是本領域的研究重點之一，而上述結縷草轉基因工作所面臨的問題極大的限制了本領域工作的深入開展。

因此，亟需尋找一種操作簡便、轉化率高且耗時較短的結縷草的轉基因方法。

發明內容

針對現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種高效對結縷草進行轉基因的方法，該方法不僅操作簡便、轉化率高，更重要的是所需時間非常短，該方法包括如下步驟：

1）從結縷草成熟種子中剪切出成熟胚，將胚置于愈傷誘導培養基中培養3-7天；

2）對含有外源質粒的農桿菌進行活化，利用液體愈傷繼代培養基對農桿菌進行懸浮，得到農桿菌懸浮液；

3）將步驟1）培養所得植物組織置于步驟2）所準備的農桿菌懸浮液中，真空干燥器處理30分鐘后，緩慢振蕩培養1小時；

4）取出植物組織，置于含有乙酰丁香酮的固體愈傷繼代培養基中避光共培養至少3天；所述乙酰丁香酮的濃度為20mgL^-1。

發明人通過大量的實驗發現，對結縷草的成熟胚進行3-7天的預培養后，利用農桿菌介導法對結縷草進行轉基因操作，可以獲得較好的轉化效率。如本發明的實施例所示，利用GUS活性檢測法對轉化效率時發現，僅需對結縷草成熟胚預培養3天，便可成功的利用農桿菌介導法對其進行轉化。整個轉基因過程總共僅需不足10天，相較于現有技術長達3個月的轉基因過程而言，大幅提高了研究效率，極大促進了結縷草優良品種選育工作的開展。

在植物轉基因領域當中，植物的種類和轉基因方法對轉基因的成功與否和效率高低起著決定性的作用。然而，至目前為止，對何種植物適合何種轉基因方法，仍未形成共識。特別的，在轉基因過程中，采取植物中的哪個部分作為外植體并進行何種處理可以獲得高效的轉化效果，更是沒有定論。如《植物轉基因技術的進展存在問題及突破方向》（董福雙，河北農業科學,2011,15(3):57-65）所記載，利用不同轉化方法對不同作物進行轉基因操作，轉化率的差異十分巨大，轉化率可低至小于0.5%，且可重復性差。

本發明的發明人經過大量實驗摸索發現，將預培養3天以上的成熟胚作為外植體時，不但可以成功對結縷草進行轉化，更重要的時本發明大幅減少了整個轉基因過程所耗費的時間。本領域人員可以理解的是，本發明極大的促進了結縷草其它相關研究的開展，尤其是促進了結縷草優良品種的選育工作。

本領域人員應當知曉，除大幅縮短轉基因所需時間外，本發明對本領域還具有如下貢獻：本發明無需進行長時且專業的細胞培養工作，提高了轉基因的可重復性；本發明無需對外植體進行繁瑣的滅菌工作，而以胚性愈傷組織作為外植體時，繁瑣的滅菌工作是必須的。

優選的，所述步驟1）的培養時間為7天。

優選的，所述步驟4）中，共培養時間為9天。

優選的，步驟2）中農桿菌的活化方法為：于200rpm、28℃下，對含有外源質粒的農桿菌進行培養，培養基含有5gL^-1酵母提取物、10gL^-1細菌蛋白胨、5gL^-1氯化鈉、50mgL^-1卡拉霉素，pH為7.0，培養至OD₆₀₀=0.3-0.6；利用MT4-S液體培養基對農桿菌進行重懸，調節懸浮液的OD₆₀₀=0.5。