[發(fā)明專利]一種結(jié)縷草的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510542670.0
• 申請日: 2015-08-31
• 公開（公告）號: CN105039393A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發(fā)明（設計）人: 王迅;馬嘯;汪志輝;張新全;付剛;賴云松;梁東;林立金;唐懿;夏惠
• 申請（專利權）人: 四川農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 王震秀

1.一種結(jié)縷草的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

1）從結(jié)縷草成熟種子中剝離出胚，將胚置于愈傷誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少3天；

2）對含有外源質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進行活化，利用液體愈傷繼代培養(yǎng)基對農(nóng)桿菌進行懸浮，得到農(nóng)桿菌懸浮液

3）將步驟1）培養(yǎng)所得植物組織置于步驟2）所準備的農(nóng)桿菌懸浮液中，真空干燥器處理30分鐘后，緩慢振蕩培養(yǎng)1小時；

4）取出植物組織，置于含有乙酰丁香酮的固體愈傷繼代培養(yǎng)基中避光共培養(yǎng)至少3天；所述乙酰丁香酮的濃度為20mgL^-1。

2.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述步驟1）的培養(yǎng)時間為7天。

3.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述步驟4）中，共培養(yǎng)時間為9天。

4.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟2）中農(nóng)桿菌的活化方法為：于200rpm、28℃下，對含有外源質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有5gL^-1酵母提取物、10gL^-1細菌蛋白胨、5gL^-1氯化鈉、50mgL^-1卡拉霉素，pH為7.0，培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.3-0.6。

5.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，利用MT4-S液體培養(yǎng)基對農(nóng)桿菌進行懸浮時，調(diào)節(jié)懸浮液的OD₆₀₀=0.5。

6.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述外源質(zhì)粒為含有植物抗性選擇基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus報告基因的pMDC99IG質(zhì)粒。

7.根據(jù)權利要求6所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述含有植物抗性選擇基因hpt基因和β-葡萄糖苷酸酶基因gus報告基因的pMDC99IG質(zhì)粒是通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中的。

8.根據(jù)權利要求1、4、5、7中任一項所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌菌株為EHA105。

9.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述愈傷誘導培養(yǎng)基包含MS基礎培養(yǎng)基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1維生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、5mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-芐氨基腺嘌呤，所述愈傷誘導培養(yǎng)基的pH值為5.8，用2gL^-1植物凝膠固化；所述液體愈傷繼代培養(yǎng)基包含MS基礎培養(yǎng)基中的成分和其它成分，所述其它成分包括：30gL^-1蔗糖、4mgL^-1維生素B1、100mgL^-1α-酮戊二酸、2mgL^-12,4-二氯苯氧乙酸、0.2mgL-¹6-芐氨基腺嘌呤，所述液體愈傷繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8；所述固體愈傷繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8，用2gL^-1植物凝膠固化。

10.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，所述方法還包括在步驟1）前對結(jié)縷草成熟種子進行預處理，所述預處理步驟包括：

A）將種子在水中浸泡2天；

B)置于含1%活性氯的次氯酸鈉溶液中攪拌滅菌2小時，然后用無菌水反復清洗。