[發明專利]一種定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法

在審

• 申請號: 201510542254.0
• 申請日: 2015-08-28
• 公開（公告）號: CN105136953A
• 公開（公告）日: 2015-12-09
• 發明（設計）人: 曹成喜;張柳霞;曹毅仁;肖華;樊柳蔭
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N27/447
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中;陳少凌

1.一種定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

A、對純乳品和待測樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，比對所述待測樣品與所述純乳品電泳指紋圖譜是否相同、密度是否一致；選出電泳指紋圖譜中待測樣品區別于所述純乳品的差異條帶，并將所述差異條帶切割、酶解；

B、對所述酶解后的樣品進行液相色譜質譜聯用分析實驗，將所述分析結果中相對豐度高的蛋白質與現有數據庫中蛋白進行比對，確定所述待測樣品中摻次蛋白的種類；

C、分別以所述純乳品和所述摻次蛋白的純品為標準品，進行移動反應界面電泳滴定，利用移動反應界面阻滯信號R_MRB與蛋白濃度存在的線性關系建立兩條標準曲線，獲得所述純乳品的標準曲線斜率α₁、所述摻次蛋白純品的標準曲線斜率α₂以及截距b；

D、采用與步驟C條件相同的移動反應界面電泳滴定法，對所述待測樣品進行移動反應界面電泳滴定，獲得阻滯信號R_mix，并檢測其蛋白濃度C_mix；

E、將所述阻滯信號R_mix、蛋白含量C_mix帶入方程式獲得待測樣品中所述摻次蛋白質和乳品蛋白的濃度比值；

其中，C_pro，1為待測樣品中乳品的蛋白質濃度，C_pro，2為待測樣品中摻次蛋白的濃度。

2.根據權利要求1所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟A中，所述十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳的濃度T值為10～14％，樣品濃縮時施加的電壓為75～90V，樣品分離時施加的電壓為110～130V。

3.根據權利要求1所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟A中，所述酶解所采用的是胰蛋白酶且為序列級別。

4.根據權利要求1所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟B中，所述液相色譜質譜聯用分析實驗，采用納升級高效液相色譜液相系統Dionexuitimate3000進行分離。

5.根據權利要求1或4所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟B中，所述的液相色譜質譜聯用分析實驗，采用的流動相A為99.9％水和0.1％甲酸，流動相B為99.9％乙腈和0.1％甲酸，上樣緩沖液為2％乙腈、97.9％水及0.1％甲酸，其中，百分比具體指體積百分比。

6.根據權利要求1所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟B中，所述現有數據庫包括NCBI。

7.根據權利要求1所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟B中，所述摻次蛋白選自乳制品或非乳制品蛋白食品。

8.根據權利要求1所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟C、D中，所述移動反應界面電泳滴定中采用的凝膠為聚丙烯酰胺凝膠，重量體積濃度為10.0～20.0％，交聯度為2.0～8.0％；所述移動反應界面電泳滴定中施加的電場為2～8V/mm；所述移動反應界面電泳滴定為酸式移動反應界面電泳滴定或堿式移動反應界面電泳滴定。

9.根據權利要求1或8所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，所述移動反應界面電泳滴定中，陽極液是離子強度20～200mmol/L的鹽酸與氯化鈉或者氯化鉀的混合溶液，陰極液為離子強度20～200mmol/L的氯化鈉或者氯化鉀溶液，背景電解質溶液為離子強度20～200mmol/L的氯化鈉或者氯化鉀溶液。

10.根據權利要求1所述的定性、定量一體化檢測乳品摻次的方法，其特征在于，步驟D中，所述蛋白濃度C_mix是通過凱氏定氮法或BCA法測得的。