[發(fā)明專利]鑒別檢測正常漿細(xì)胞和克隆性漿細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510539692.1
• 申請日: 2015-08-28
• 公開（公告）號: CN105223360B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉艷榮;王亞哲;常艷;郝樂;袁曉英;黃曉軍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)人民醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/533;G01N15/14
• 代理公司: 石家莊眾志華清知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(特殊普通合伙)13123
• 代理人: 墨偉

本發(fā)明屬于細(xì)胞表型確認(rèn)過程中的專用試劑盒結(jié)構(gòu)設(shè)計，具體涉及一種應(yīng)用八色抗體組合識別克隆性漿細(xì)胞表型的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

漿細(xì)胞疾病是指克隆性漿細(xì)胞（clonalplasmacells，cPCs）過度增殖并產(chǎn)生大量單克隆免疫球蛋白的一組疾病，cPCs是漿細(xì)胞疾病的發(fā)病根源。免疫球蛋白固定電泳或游離輕鏈檢測可以幫助確定是否存在克隆性漿細(xì)胞，但無法提示其比例；如果cPCs為非分泌型，即不合成免疫球蛋白，則無法診斷。傳統(tǒng)的骨髓形態(tài)學(xué)方法可以識別形態(tài)異常漿細(xì)胞或幼稚漿細(xì)胞的比例，但不能確定其克隆性。某些疾病例，如意義未明的單克隆丙種球蛋白病、冒煙型骨髓瘤，或治療后的多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM），骨髓中漿細(xì)胞數(shù)量較低，且多數(shù)同時存在cPCs和正常漿細(xì)胞（normalplasmacells，nPCs），此時通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法難以鑒別。

多參數(shù)流式細(xì)胞儀（multiparameterflowcytometry，MFC）具有高敏感、高特異性。利用MFC對膜抗原檢測，可以判斷是否存在nPCs和異常表型漿細(xì)胞（abnormalplasmacells，aPCs）并確定其比例；通過對胞漿內(nèi)免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）cKappa和cLambda輕鏈檢測，可進(jìn)一步判斷nPCs是否為多克隆、aPCs是否為單克隆，以判斷是否存在cPCs及其比例；當(dāng)nPCs和aPCs同時存在且aPCs數(shù)量較低時，更顯示其優(yōu)越性。因此MFC被越來越多地應(yīng)用于漿細(xì)胞疾病的檢查，不僅可以幫助診斷，還可以在治療后檢測微量cPCs，對治療效果進(jìn)行評價，以便及時調(diào)整治療方案。

如何選擇合適的抗體組合是利用MFC準(zhǔn)確區(qū)分nPCs、aPCs和cPCs的關(guān)鍵。目前文獻(xiàn)報道多采用3-4色抗體組合，除去設(shè)門抗體，每管試管中只能檢測1-2種其它抗體，若想檢測多個抗體以確定漿細(xì)胞是否異常，需重復(fù)應(yīng)用設(shè)門抗體，大概需要3-5組抗體組合，總共需要9-20個抗體；這樣導(dǎo)致費(fèi)用過高、所需標(biāo)本量增大、操作費(fèi)時，且靈敏度不高。而且，4色抗體組合無法同時囊括設(shè)門抗體、胞膜抗體和針對胞漿Ig輕鏈的抗體，不能達(dá)到分群設(shè)門并進(jìn)一步分析克隆性的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒別檢測正常漿細(xì)胞和克隆性漿細(xì)胞的試劑盒及其應(yīng)用，其采用8色抗體組合、借助流式細(xì)胞儀一次檢測、經(jīng)逐級設(shè)門即可準(zhǔn)確區(qū)分nPCs、aPCs和cPCs并提示表達(dá)比例，檢測的敏感度高、成本低、適用范圍廣，具有廣泛的應(yīng)用前景與臨床意義。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種鑒別檢測正常漿細(xì)胞和克隆性漿細(xì)胞的試劑盒，與流式細(xì)胞儀配套使用，所述試劑盒配備針對下述物質(zhì)的單克隆抗體組合：IgκLightChain/IgλLightChain、CD19、CD117、CD138、CD56、CD38和CD45，并依次按照下述順序依次進(jìn)行熒光素標(biāo)記：FITC/PE、PE-Cy5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、V450和V500。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒在制備鑒別檢測正常漿細(xì)胞和克隆性漿細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：將所述試劑盒中針對CD19、CD117、CD138、CD56、CD38和CD45的單克隆抗體加入至同一個裝有骨髓標(biāo)本的試管中；經(jīng)溶紅細(xì)胞、破膜處理后，加入試劑盒中針對IgκLightChain/IgλLightChain的單克隆抗體，制成待測試樣；將待測試樣經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，設(shè)門分析如下：

①建立FSC/SSC密度圖，將有核細(xì)胞區(qū)域劃為R1；對R1細(xì)胞顯示CD38/CD138散點(diǎn)圖，將CD38⁺CD138⁺細(xì)胞劃為R2；建立FSC/SSC散點(diǎn)圖只顯示R2門內(nèi)細(xì)胞，將均一分布的細(xì)胞劃為R3；

②將R3門內(nèi)細(xì)胞分別建立CD19/CD56、CD19/CD45和CD19/CD117二維散點(diǎn)圖，進(jìn)一步對二維散點(diǎn)圖內(nèi)集中分布的細(xì)胞設(shè)門，標(biāo)記為R4和/或R5；

③對應(yīng)CD19/CD56、CD19/CD45和CD19/CD117中R4和/或R5門內(nèi)細(xì)胞分別依次建立CD45/CD117、CD56/CD117和CD45/CD56的二維散點(diǎn)圖；

④對應(yīng)CD19/CD56、CD19/CD45和CD19/CD117中R4和/或R5門內(nèi)細(xì)胞分別依次建立IgκLightChain/IgλLightChain二維點(diǎn)圖，分析IgκLightChain和IgλLightChain的表達(dá)及其比值。