[發明專利]一種高產酸性蛋白酶的紅曲霉菌株的構建方法

在審

• 申請號: 201510533884.1
• 申請日: 2015-08-27
• 公開（公告）號: CN105039386A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 邱思佳;沈才洪;霍丹群;唐玉明;候長軍;林鋒
• 申請（專利權）人: 瀘州老窖集團有限責任公司;重慶大學;四川省瀘州市釀酒科學研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/57;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司 50212
• 代理人: 李明;張先蕓

技術領域

本發明屬于生物育種技術領域，具體涉及一種高產酸性蛋白酶的紅曲霉菌株的構建方法。

背景技術

紅曲霉是發酵行業的功能菌株，其體內含有酸性蛋白酶Asp基因，該基因可表達產生酸性蛋白酶Asp，酸性蛋白酶Asp對白酒釀造有以下作用：

1、促進微生物生長：

微生物的發育需要有蛋白質為其提供氮源及能量，在入窖時發酵糟的酸度以及發酵初期窖內酸度較大，此時曲霉中的酸性蛋白酶可強化蛋白質分解為氨基酸，豐富酒醅中氨基酸含量，有利于微生物生長。

2、提高原材料的利用率：

酸性蛋白酶的應用可強化酒精代謝，使原料出酒率提高。

3、提供生香前體物質和風味物質：

酸性蛋白酶在釀酒的酸性環境中，將原料蛋白質水解成氨基酸，多種氨基酸是生成白酒香味成分的前體物質，經過不同微生物及酶的代謝，可生成多種香味物質。

然而，現有技術中，紅曲霉的酸性蛋白酶表達量并不高，而酸性蛋白酶酶制劑成本高、活性低，不能廣泛應用于生產，因而存在一定的缺陷。有鑒于此，如何獲得高產酸性蛋白酶的紅曲霉菌株具有十分重要的意義。為了獲得高產酸性蛋白酶的紅曲霉菌株，常見的方法有自然選育法、誘變育種法、基因重組育種法；但自然選育法的工作范圍大，誘變育種法具有不定向性且誘變后穩定性低的缺點。

發明內容

針對現有技術存在的上述不足，本發明的目的是提供一種高產酸性蛋白酶的紅曲霉菌株的構建方法，使構建得到的紅曲霉菌株具有酸性蛋白酶基因高表達量。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種高產酸性蛋白酶的紅曲霉菌株的構建方法，先從紅曲霉基因組中擴增紅曲霉酸性蛋白酶基因Asp片段，然后將擴增得到的所述Asp片段連接到空載體上構建紅曲霉酸性蛋白酶的重組表達載體，將所述紅曲霉酸性蛋白酶的重組表達載體轉化到根癌農桿菌中得到重組根癌農桿菌，再利用根癌農桿菌介導法將所述重組根癌農桿菌導入紅曲霉，得到所述高產酸性蛋白酶的紅曲霉菌株。

相比現有技術，本發明具有如下有益效果：

1、本發明創造性地從紅曲霉基因組中擴增Asp基因，利用pBC-Hygro質粒的強啟動子，將紅曲霉酸性蛋白酶基因片段與pBC-Hygro載體連接，構建重組載體pBC-Hygro-Asp，再利用根癌農桿菌介導法將Asp基因導入紅曲霉，篩選出能高產酸性蛋白酶的紅曲霉同源轉化子菌株，解決了目前紅曲霉菌株不具有高產酸性蛋白酶的性質，而且酸性蛋白酶酶制劑成本高、活性低、不能廣泛應用于生產的技術問題，具有良好的市場應用前景。

2、本發明得到的紅曲霉轉化子菌株酸性蛋白酶基因的表達量是野生型紅曲霉酸性蛋白酶基因表達量的3.30倍，能實現酸性蛋白酶的高產，具有轉化子菌株在酸性條件下分解蛋白質能力強的特點。

3、本發明采用基因重組法獲得的同源轉化子紅曲霉菌株，具有高效表達、準確加工、轉化子遺傳穩定的特點，可以在非選擇壓力下實現穩定傳代，且與異源表達相比，同源表達構建的目的菌株穩定性更強。

附圖說明

圖1為紅曲霉酸性蛋白酶PCR反應產物的電泳圖；

圖2為重組載體pBC-Hygro-Asp的構建圖譜；

圖3為pBC-Hygro空載體和重組載體pBC-Hygro-Asp的電泳圖；

圖4為重組載體pBC-Hygro-Asp擴增后的電泳圖；

圖5為紅曲霉轉化子菌株的hph驗證圖；

圖6為在含有潮霉素的麥芽瓊脂培養基上接種野生型紅曲霉菌株的菌落圖；

圖7為在含有潮霉素的麥芽瓊脂培養基上接種紅曲霉轉化子菌株的菌落圖；

圖8為在不含潮霉素的麥芽瓊脂培養基上接種紅曲霉轉化子菌株的菌落圖；

圖9為在不含潮霉素的麥芽瓊脂培養基上接種野生型紅曲霉菌株的菌落圖；

圖10為發酵液中酸性蛋白酶產生的透明圈；

圖11為紅曲霉酸性蛋白酶基因qPCR結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例和說明書附圖對本發明作進一步詳細說明。