[發(fā)明專(zhuān)利]PH450酶的大量制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510533850.2
• 申請(qǐng)日: 2015-08-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105112378B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沃納·阿爾伯
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳無(wú)斑時(shí)代科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/02
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/02
• 代理公司: 北京市中聞律師事務(wù)所 11388
• 代理人: 王紅俊;常亞春

本發(fā)明提供了一種PH450酶的大量制備方法，包括：獲取藍(lán)藻并進(jìn)行大量培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過(guò)程中用PH450酶誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)；在大量培養(yǎng)結(jié)束后收集藍(lán)藻細(xì)胞，提取藍(lán)藻細(xì)胞總蛋白；用人PH450酶作為抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，制備多克隆抗體；以多克隆抗體作為親和介質(zhì)制備親和層析柱；將提取的藍(lán)藻細(xì)胞總蛋白于所述親和層析柱進(jìn)行過(guò)柱。本發(fā)明上述PH450酶的大量制備方法，基于藍(lán)藻和人PH450酶在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、活性功能幾乎完全相同，且藍(lán)藻代謝簡(jiǎn)單、易于誘導(dǎo)和分離的情形，將藍(lán)藻誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物用PH450酶的特異性抗體進(jìn)行親和層析；相比現(xiàn)有的基因工程菌發(fā)酵制備的方法，本發(fā)明大量制備的PH450酶是藍(lán)藻細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的活性酶，品質(zhì)比較好具有活性；而且純化分離過(guò)程簡(jiǎn)單，方法的效益更高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種PH450酶的大量制備方法。

背景技術(shù)

PH450色素代謝酶系，或者又稱(chēng)CYPH450酶、P450酶，是一類(lèi)主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，多位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，催化多種內(nèi)、外源物質(zhì)的（包括大多數(shù)臨床藥物）代謝，因?yàn)榉止夤舛确y(cè)得的吸收峰在450nm附近，故名。其主要分布在SER（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜）中，但也存在于質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、過(guò)氧化物酶體、核膜等細(xì)胞器的膜中，具有解毒作用，通?？蓪⒅苄杂卸疚镔|(zhì)，代謝為水溶性物質(zhì)，使有毒物質(zhì)排出體外。由于其作為一種末端加氧酶，參與了生物體內(nèi)的解毒、甾醇類(lèi)激素合成等過(guò)程，還是藥物代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，而且對(duì)細(xì)胞因子和體溫調(diào)節(jié)都有重要影響；并且，其色素代謝功能可以迅速溶解和代謝皮膚各層次各種色數(shù)及毒素，打通皮膚排毒通道；所以在藥物輔助吸收和面部色素清除等產(chǎn)品中均有廣泛的應(yīng)用。

目前，由于本身PH450酶發(fā)現(xiàn)是大量存在于人的肝臟中，雖然后續(xù)也發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌、真菌及動(dòng)植物中有其存在，比較難以自然地通過(guò)除雜并分離大量制備得到；為了滿足大量應(yīng)用的要求，大量進(jìn)行PH450酶制備的過(guò)程一般是通過(guò)構(gòu)建PH450酶基因工程菌的方式在體外進(jìn)行大量表達(dá)獲得。但是這一方式進(jìn)行制備的過(guò)程中，由于表達(dá)的基因工程菌是根據(jù)基因序列表達(dá)獲得PH450酶蛋白產(chǎn)物，由于不存在體內(nèi)代謝過(guò)程中的表達(dá)后的功能修飾步驟，所以這一種方式制備得到的PH450酶的活性和品質(zhì)大大降低，遠(yuǎn)無(wú)法達(dá)到高品質(zhì)應(yīng)用的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服現(xiàn)有的缺陷，提供一種從藍(lán)藻中進(jìn)行具有完整生物活性PH450酶的大量制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：

一種PH450酶的大量制備方法，包括如下步驟：

獲取藍(lán)藻并進(jìn)行大量培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過(guò)程中用PH450酶誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)；

在所述大量培養(yǎng)結(jié)束后收集藍(lán)藻細(xì)胞，提取藍(lán)藻細(xì)胞總蛋白；

用人PH450酶作為抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，制備多克隆抗體；

以所述多克隆抗體作為親和介質(zhì)制備親和層析柱；

將所述提取的藍(lán)藻細(xì)胞總蛋白于所述親和層析柱進(jìn)行過(guò)柱。

本發(fā)明上述PH450酶的大量制備方法，基于藍(lán)藻和人PH450酶在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)、活性功能幾乎完全相同，且藍(lán)藻代謝簡(jiǎn)單、易于誘導(dǎo)和分離的情形，將藍(lán)藻誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)物用PH450酶的特異性抗體進(jìn)行親和層析；相比現(xiàn)有的基因工程菌發(fā)酵制備的方法，本發(fā)明大量制備的PH450酶是藍(lán)藻細(xì)胞代謝產(chǎn)生的在經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)功能修飾的活性酶，品質(zhì)比較好；而且純化分離過(guò)程簡(jiǎn)單，方法的效益更高。

附圖說(shuō)明

下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：

圖1為人類(lèi)CYP2C9與細(xì)菌CYPH450 BM3晶體結(jié)構(gòu)的重疊圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例以藍(lán)藻培養(yǎng)物進(jìn)行層析之后洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳銀染的示意圖。