[發明專利]一種檢測辣椒黃脈病毒的RT-LAMP引物及試劑盒

在審

• 申請號: 201510526746.0
• 申請日: 2015-08-25
• 公開（公告）號: CN105039600A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 湯亞飛;何自福;佘小漫;藍國兵
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于植物病毒檢測領域，具體涉及一種檢測辣椒黃脈病毒的RT-LAMP引物及試劑盒。

背景技術

辣椒黃脈病毒(Pepperveinyellowvirus，PeVYV)屬黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)成員，由蚜蟲持久方式傳播，可以嫁接傳播。該病毒在歐洲的西班牙、荷蘭，非洲的馬里、蘇丹，亞洲的印度、印度尼西亞、菲律賓、泰國、日本、中國臺灣以及北美洲的美國等地均有分布。2013年以來，先后在我國的湖南、山東和廣東等3省份也發現辣椒黃脈病毒，田間癥狀主要表現為葉脈黃化、葉片卷曲、節間縮短等，嚴重影響到辣椒的產量和品質。目前，檢測辣椒黃脈病毒(Pepperveinyellowvirus，PeVYV)的方法主要是反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法。RT-PCR檢測方法主要包括：根據已知病毒保守序列設計RT-PCR引物，提取病樣中的總RNA，以其中的病毒基因組RNA作為模板，在PCR管中加入逆轉錄酶、模板、RT-PCR反應成分，PCR儀上進行反應及瓊脂糖凝膠電泳檢測等步驟。該方法特異、較靈敏，但需要購買專業儀器PCR儀，且較為費時。目前利用RT-PCR檢測病毒需要6小時左右。

環介導等溫擴增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)技術，是利用能識別靶序列上6個特異區域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增的BstDNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速和特異地擴增靶序列。LAMP呈瀑布式擴增，其擴增效率非常高，反應非常靈敏；利用識別靶序列上的6～8個特異性位點，其特異性很高；反應在60～65℃恒溫下進行，只要水浴鍋即可，無需特殊的儀器，操作非常簡單；整個檢測反應只需1.0～1.5h，檢測周期短。因此，該方法具有檢測速度快、靈敏度高及不需要昂貴的專業儀器等優點。

發明內容

為了克服現有技術的缺點和不足，本發明的首要目的在于提供一種檢測辣椒黃脈病毒的RT-LAMP引物。

本發明的另一目的在于提供一種含有上述RT-LAMP引物的辣椒黃脈病毒RT-LAMP檢測試劑盒。

本發明的第三個目的在于提供一種利用上述RT-LAMP引物或RT-LAMP檢測試劑盒檢測辣椒黃脈病毒的方法，該方法快速、靈敏、簡便。

本發明的第四個目的在于提供上述RT-LAMP引物或RT-LAMP檢測試劑盒的應用。

一種檢測辣椒黃脈病毒的RT-LAMP引物，包括一對外側引物F3和B3以及一對內側引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：

F3:GATCACGTAACACCCGCC；

B3:GCTCTCTGATAGAGACGGCC；

FIP:GCCTCCATTTCGTCGTCTTCGA-GTTCGCCCTGTCGTTGTG；

BIP:TTGGAGGAAGGTCGAGCAACAG-AAGGTGACAGATCCTGAGGA；

一種辣椒黃脈病毒RT-LAMP檢測試劑盒，包含上述RT-LAMP引物；

所述的辣椒黃脈病毒RT-LAMP檢測試劑盒，優選包含如下組分：上述RT-LAMP引物；RT-LAMP反應液；酶溶液；核酸熒光染料；

所述的RT-LAMP反應液優選包含如下組分：Tris-HCl(pH8.8)40mM；KCl20mM；MgSO₄16mM；(NH₄)₂SO₄20mM；Tween200.2％(w/w)；Betaine1.6M；dNTPs每種2.8mM；

所述的酶溶液優選為BstDNA聚合酶和AMV逆轉錄酶的混合溶液；

所述的核酸熒光染料優選為熒光目視檢測試劑(容研生物科技(中國)有限公司產品)；

一種檢測辣椒黃脈病毒的方法，包含如下步驟：

以待測樣品的RNA為模板，利用RT-LAMP引物或RT-LAMP檢測試劑盒進行RT-LAMP擴增反應；反應結束后觀察RT-LAMP擴增反應溶液顏色變化，若反應液顯綠色，則判斷為陽性反應；若反應液顯橙色，則判斷為陰性反應；