[發明專利]小麥黃花葉病毒雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201510522332.0
• 申請日: 2015-08-20
• 公開（公告）號: CN105137074A
• 公開（公告）日: 2015-12-09
• 發明（設計）人: 任春梅;程兆榜;楊柳;繆倩;周益軍
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種小麥黃花葉病毒雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測方法及應用。

背景技術

小麥黃花葉病毒(Wheatyellowmosaicvirus，WYMV)是一種由禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)傳播的麥類土傳病毒，禾谷多黏菌是一種專性寄生于植物根部的真核低等生物，該介體分布范圍廣，可在30多種禾谷類作物和雜草上寄生，且擁有抗逆性很強的休眠孢子和完成侵染循環的游動孢子，只要條件適宜，即可激發游動孢子攜帶病毒侵染寄主的根系，造成嚴重的病害。小麥黃花葉病由日本的Sawada在1927年首次發現并描述，至今仍是麥類生產上的一種重要病害。在自然條件下WYMV常與中國小麥花葉病毒(Chinesewheatmosaicvirus，CWMV)復合侵染小麥，導致嚴重的田間病害，這兩類病毒都屬于真菌傳棒狀病毒組，電鏡下觀察病毒粒子為直棒狀二分體。

小麥黃花葉病主要分布在日本、韓國和中國。我國目前主要分布于長江、黃河中下游和淮河流域，包括四川、陜西、江蘇、浙江、安徽、湖北、山東和河南等省，其中江蘇省的里下河地區和寧鎮揚丘陵地區、湖北省東北沿大別山地區、陜西省渭河流域關中地區發生較重。該病害已經成為我國冬小麥產區的一種重要的病毒病，對小麥的產量和品質有嚴重影響。一般病田發病減產10％-30％，嚴重的達70％-80％，甚至絕收。為了監測和防控小麥黃花葉病的發生和擴散，急需建立該病害的高度特異和靈敏的檢測方法。

目前，對病害的檢測方法主要有直接觀察法、分子生物學法和血清學方法。癥狀觀察是判斷田間發病情況的一種比較常用和直觀的方法。但由于發病癥狀的相似性，隱癥現象，以及復合侵染的情況，所以這種方法一般情況下判斷不夠準確。RT-PCR的檢測方法雖然比較靈敏且特異性好，但由于它的花費成本大且儀器要求高，一般局限于實驗室用。綜合而言，血清學方法操作簡便、特異性好、靈敏度高且成本低，更適用于田間大規模樣品的檢測，并易于在基層進行推廣。WYMV的血清學檢測方法是通過制備抗血清，利用ELISA或Westernblot對病毒進行檢測和研究。向榮等和韓成貴等分別制備了WYMVP1和CP的抗血清，可以通過ELISA或Westernblot等血清學手段檢測病毒；尚巧霞等建立了WYMVELISA檢測系統。但這些以多抗建立的血清學方法未見其在田間樣品大規模檢測中應用的報道。因此本實驗室利用提純的WYMV病毒粒子為免疫原，經雜交瘤技術獲得了幾株能夠高效分泌抗WYMV單克隆抗體的雜交瘤細胞株，利用雜交瘤細胞制備了腹水單抗。在常規以單抗為核心建立的能準確檢測小麥中WYMV的ACP-ELISA、TAS-ELISA、dot-ELISA等血清學方法的基礎上，有研究表明生物素-親和素(Biotin-Avidin)技術是近年來發展迅速的一門生物學技術，依靠其高度的特異親和性、復合物的穩定性、可與酶及固相載體等的偶聯性、多級放大性等特點，現已廣泛應用于生物學、分子生物學、生物化學、臨床醫學等，目前應用于植物病毒的檢測上還較少，基于提高WYMV血清學檢測方法的靈敏度、特異性、可操作性和推廣性等方面，本研究對WYMV抗體進行了配對篩選和生物素標記，建立了WYMV雙抗夾心生物素-親和素ELIAS檢測方法，并成功應用于田間小麥黃花葉病毒的檢測，為WYMV田間大規?？焖贆z測的實現提供了物質和技術支撐，從而推動了小麥黃花葉病的預報預警和科學防控體系的建立。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種操作簡便、費用低廉、靈敏度高、特異性強、應用廣泛且適合大量樣本檢測的小麥黃花葉病毒(WYMV)雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種小麥黃花葉病毒雙抗夾心生物素-親和素ELISA檢測方法，包括以下步驟：

1)每孔用100uL病毒特異性抗體包被酶標板，37℃放置2h后，4℃過夜放置，洗板，甩干；

2)每孔加入200uL含10％小牛血清的磷酸鹽緩沖液，37℃孵育2h，洗板，甩干；

3)每孔分別加入100uL待檢病毒樣品、陽性和陰性樣品，37℃孵育1h，洗板，甩干；

4)每孔加入100uL生物素標記的二抗，37℃孵育1h，洗板，甩干；

5)每孔加入100uL親和素標記的酶，37℃孵育1h，洗板，甩干；

6)每孔加入100uL顯色底物，37℃孵育5～15min進行顯色反應，肉眼觀察顯色后每孔加入100uL終止液，用酶標儀測定OD值，以大于等于陰性對照OD值3倍的作物陽性結果的閾值。