[發明專利]日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 201510519076.X
• 申請日: 2015-08-21
• 公開（公告）號: CN105153290B
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 胡薇;柴日奕;王吉鵬;徐斌;李健;張瑞祥;劉牧;辛玥;莫筱瑾;張颋
• 申請（專利權）人: 復旦大學;中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/12;C12N15/11;C12N15/70;A61K39/00;A61P33/12
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示；該日本血吸蟲SjCTRL重組蛋白采用如下方法制備：

1)日本血吸蟲SjCTRL基因序列的擴增：設計SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其互補鏈和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互補鏈為引物，以日本血吸蟲cDNA為模板進行PCR擴增；所得PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，并回收純化；

2)日本血吸蟲SjCTRL基因重組質粒的構建和鑒定；

3)將該重組質粒轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達，得到表達的重組蛋白；

4)Ni-NTA瓊脂糖親和柱純化表達的重組蛋白。

2.一對用于日本血吸蟲SjCTRL基因PCR擴增的特異性引物，其序列為：

上游：(如SEQ ID NO:3所示)或其互補鏈；

下游：(如SEQ ID NO:4所示)或其互補鏈。

3.一種如權利要求1所述的日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)日本血吸蟲SjCTRL基因序列的擴增：設計SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其互補鏈和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其互補鏈為引物，以含日本血吸蟲cDNA為模板進行PCR擴增；所得PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，并回收純化；

2)日本血吸蟲SjCTRL基因重組質粒的構建和鑒定；

3)將該重組質粒轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達，得到表達的重組蛋白；

4)Ni-NTA瓊脂糖親和柱純化表達的重組蛋白。

4.如權利要求3所述的日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟1)中，所述PCR擴增的反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環，72℃延伸10min；最后保存于4℃。

5.如權利要求3所述的日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟2)具體為：將步驟1)所得的PCR產物片段與質粒載體pET-28a(+)分別用限制性內切酶BamHⅠ和Xho I進行雙酶切，并回收純化；根據純化后的目的基因片段和載體酶切片段的濃度進行連接，構建成SjCTRL編碼基因原核表達的重組質粒pET-28a(+)-SjCTRL；將此重組質粒通過CaCl₂法轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，培養后涂布于含卡那霉素LB瓊脂平板上，隨機挑取上述平板上的菌落，培養后收集菌體，抽提菌體中所含重組質粒，進行PCR鑒定、測序鑒定。

6.如權利要求5所述的日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟3)具體為：通過鈣轉化將步驟2)測序鑒定無誤的pET-28a(+)-SjCTRL重組質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中，培養后涂布于含卡那霉素的LB瓊脂平板上；隨機挑取上述平板上的菌落，培養大腸桿菌至對數生長期，加入誘導劑繼續培養；SDS-PAGE電泳鑒定誘導表達結果，直接以全菌體電泳顯示。

7.如權利要求3所述的日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟4)具體為：取表達日本血吸蟲重組蛋白SjCTRL量較高的凍存菌種劃線于含卡那霉素的LB瓊脂平板上，培養過夜之后，隨機挑取上述平板上的菌落接種至同樣含卡那霉素的液體培養基，培養菌液至對數生長期，加入誘導劑繼續培養，最后收取菌體；在上述菌體中加入蛋白抽提劑裂解細菌，離心后保留上清液與沉淀，由SDS-PAGE電泳鑒定結果；根據上述結果，用變性劑裂解所得沉淀，用Ni-NTA瓊脂糖親和柱進行純化，SDS-PAGE檢驗純化結果。

8.一種日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白在制備抗日本血吸蟲疫苗中的應用，所述日本血吸蟲SjCTRL重組抗原蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。