[發(fā)明專利]IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測引物組合物和試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510518329.1
• 申請日: 2015-08-21
• 公開（公告）號: CN105002294A
• 公開（公告）日: 2015-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李江浩;朱柳;王佳;袁太明
• 申請（專利權(quán)）人: 北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京同輝知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11357
• 代理人: 孫艷敏;楊敬

1.IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測引物組合物，其特征在于，包括IL28B860位點(diǎn)檢測引物和/或IL28B917位點(diǎn)檢測引物，其中，

IL28B860位點(diǎn)檢測引物由以下序列組成：

IL28B860-F1：SEQ?ID?NO:1所示核苷酸序列，

IL28B860-F2：SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列，

IL28B860-R：SEQ?ID?NO:3所示核苷酸序列；

IL28B917位點(diǎn)檢測引物由以下序列組成：

IL28B917-F1：SEQ?ID?NO:4所示核苷酸序列，

IL28B917-F2：SEQ?ID?NO:5所示核苷酸序列，

IL28B917-R：SEQ?ID?NO:6所示核苷酸序列；

其中，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端均標(biāo)記熒光標(biāo)記基團(tuán)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測引物組合物，其特征在于，還包括HER2內(nèi)標(biāo)引物，由以下序列組成：

HER2-F：SEQ?ID?NO:7所示核苷酸序列，

HER2-R：SEQ?ID?NO:8所示核苷酸序列；

HER2-F的核苷酸序列5’端標(biāo)記與IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端熒光標(biāo)記基團(tuán)顯色不同的熒光標(biāo)記基團(tuán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測引物組合物，其特征在于，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端標(biāo)記FAM基團(tuán)，HER2-F的核苷酸序列5’端標(biāo)記HEX基團(tuán)。

4.權(quán)利要求1~3任一所述的IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測引物組合物在制備IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑中的應(yīng)用。

5.一種IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1~3任一所述的IL28B860位點(diǎn)檢測引物、IL28B917位點(diǎn)檢測引物和HER2內(nèi)標(biāo)引物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，還包括IL28B860(C/T)陽性質(zhì)控品、IL28B917(T/G)陽性質(zhì)控品、IL28B內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品、IL28B陰性質(zhì)控品和PCR反應(yīng)液，其中，IL28B860(C/T)陽性質(zhì)控品為雜合基因型IL28B860(C/T)滅活全血，IL28B917(T/G)陽性質(zhì)控品為雜合基因型IL28B917(T/G)滅活全血，IL28B內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品為HER2基因片段，IL28B陰性質(zhì)控品為純化水，PCR反應(yīng)液包括dNTPs、Mg²⁺、TaqDNA聚合酶和UDG酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，分為7個獨(dú)立包裝的體系，分別為IL28B860(C/T)陽性質(zhì)控品、IL28B917(T/G)陽性質(zhì)控品、IL28B內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品、IL28B陰性質(zhì)控品、PCR反應(yīng)液、IL28B860位點(diǎn)檢測引物混合物和IL28B917位點(diǎn)檢測引物混合物；IL28B860位點(diǎn)檢測引物混合物包括：IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B860-R、HER2-F和HER2-R；

IL28B917位點(diǎn)檢測引物混合物包括：IL28B917-F1、IL28B917-F2、IL28B917-R、HER2-F和HER2-R。

8.權(quán)利要求6或7所述的IL28B基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，待檢樣品、兩種陽性質(zhì)控品、IL28B內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品分別進(jìn)行DNA提取操作，提取的DNA需要用紫外分光光度計測定濃度，確保樣品無蛋白或RNA污染，OD260/OD280?=1.8~2.0，OD260/OD230≥2.0；陰性質(zhì)控品提取DNA時需要加少量內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品參與提取；

所得每種提取液分成兩份，其中一份加入IL28B860位點(diǎn)檢測引物混合物和PCR反應(yīng)液，另一份加入IL28B917位點(diǎn)檢測引物混合物和PCR反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序如下：

37℃?UDG酶反應(yīng)2分鐘；95℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性15秒，60℃退火20秒，72℃延伸20秒，重復(fù)40個循環(huán)；72℃延伸10分鐘，25℃儀器冷卻1分鐘；

將各份PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別用純化水稀釋后，與分子量內(nèi)標(biāo)和Hi-Di?Formamide一起混合均勻，轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳；

結(jié)果判斷：

HEX內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物必須全部出峰，否則視為實(shí)驗(yàn)失敗；HEX內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物全部出峰的情況下，

IL28B860位點(diǎn)基因型判斷：IL28B860反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物只在158bp片段處出現(xiàn)顯色峰，表明待檢樣本為CC純合基因型，只在161bp片段處出現(xiàn)顯色峰，表明待檢樣本為TT純合基因型，兩個位置均出現(xiàn)顯色峰，表明待檢樣本為CT雜合基因型；

IL28B917位點(diǎn)基因型判斷：IL28B917反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物只在240bp片段處出現(xiàn)顯色峰，表明待檢樣本為TT純合基因型，只在243bp片段處出現(xiàn)顯色峰，表明待檢樣本為GG純合基因型，兩個位置均出現(xiàn)顯色峰，表明待檢樣本為TG雜合基因型。