[發明專利]一種庫爾勒香梨花絲細胞立體染色方法

有效

• 申請號: 201510517411.2
• 申請日: 2015-08-21
• 公開（公告）號: CN105136547B
• 公開（公告）日: 2018-01-02
• 發明（設計）人: 許娟;李鵬;李勇;郭春苗
• 申請（專利權）人: 新疆農業科學院園藝作物研究所
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種庫爾勒香梨花絲細胞立體染色方法，其特征在于，具體方法步驟如下：

（1）樣品固定：在庫爾勒香梨花期時，從樹體上采摘花絲固定在FAA液體中，第3天更換一次FAA液體，第7天再更換一次FAA液體，第15天再更換一次FAA液體，并將裝有花絲的固定液保存在4±0.5℃冰箱中；

所述的FAA液體為：分別配置60%酒精溶液和40%甲醛溶液，并按照體積比為60%酒精溶液:冰乙酸:40%甲醛溶液=90:5:5，將這三種液體混合，即為制備的FAA液體；

（2）切片處理：取出步驟（1）FAA液體中的樣品，用50%的乙醇浸洗15min，50%的乙醇浸泡1.5h，70%的乙醇浸泡1.5h，80%的乙醇浸泡1.5h，90%的乙醇浸泡1.5h，更換90%的乙醇，再次浸泡 1.5h，無水乙醇浸泡 1h，更換無水乙醇，再次浸泡 1h，無水乙醇和二甲苯混合溶液浸泡 2h，二甲苯浸泡 50 min，更換二甲苯溶液，再次浸泡 50min，二甲苯和石蠟混合溶液在 39℃恒溫箱內浸泡 12h，在 62-63℃恒溫箱內石蠟溶液中浸泡，每 6 h 換一次干凈的、過濾過的石蠟溶液，一共更換 3-5 次，包埋，待紙盒內蠟液凝固后，自來水浸泡 8h，晾干，修蠟塊，用石蠟切片機將庫爾勒香梨花絲切成 12-14um 厚，放到干凈的載玻片上，滴水展片，40℃展片臺展片 1-2h，至蠟片完全展開，二甲苯脫蠟 10min，在二甲苯和無水乙醇的混合溶液浸泡5min，95%體積的乙醇浸泡3min，90%的乙醇浸泡3min，80%的乙醇浸泡3min，70%的乙醇浸泡3min，50%的乙醇浸泡3min，30%的乙醇浸泡3min，蒸餾水浸泡1min；

所述的無水乙醇和二甲苯混合溶液：按照體積比為無水乙醇：二甲苯溶液=1:1的比例混合后的溶液；

所述的二甲苯和石蠟混合溶液：按照體積比為二甲苯：石蠟溶液=1:1的比例混合后的溶液；

所述的包埋為：將蠟液中的庫爾勒香梨花絲連同蠟液倒到紙盒中；

（3）染色：利用改良的蘇木精染液對步驟（2）中處理好的切片進行染色，染色時間為20-30min，顏色呈現黑色； 改良的蘇木精染液制備為 4% 蘇木精無水酒精溶液、30% 過氧化氫溶液、碘 - 碘化鉀溶液和10% 硫酸鋁鉀溶液按照體積比 20:1:15:10 進行混合，靜置 1h，即為制備的改良的蘇木精染液；其中碘-碘化鉀溶液制備為將30ml蒸餾水加熱，加入1g碘化鉀，待碘化鉀充分溶解后， 再加入1g碘，靜置一個星期后即可制備所得；

（4）脫色：用干凈的蒸餾水浸泡步驟（3）染色后的載玻片，并來回移動蒸餾水中的載玻片，直到洗凈載玻片上的染色液；

（5）分色：根據染色程度，用1%氯化鋁溶液處理步驟（4）的載玻片30-50s，至細胞結構清晰，再用雙蒸水浸泡切片，洗去多余的1%氯化鋁溶液；

（6）制作永久切片：將步驟（5）分色后的載玻片按照下述步驟進行處理，制備永久切片，即步驟（5）分色后的載玻片，90%的乙醇浸泡1min，95%的乙醇浸泡1min，無水乙醇浸泡3min，無水乙醇和二甲苯的混合溶液浸泡 10min，二甲苯浸泡 5min，更換二甲苯溶液，再次浸泡5min，中性樹膠封片，制作成永久切片；

所述的無水乙醇和二甲苯混合溶液：按照體積比無水乙醇：二甲苯溶液為1:1的比例混合后的溶液；

（7）光學顯微鏡拍照和觀測：在溫度為38℃-42℃的烘箱烘烤步驟（6）制備的永久切片12-24h，直至永久切片烘干，用高倍顯微鏡拍照，并觀測庫爾勒香梨花絲的細胞結構。

2.如權利要求1所述的一種庫爾勒香梨花絲細胞立體染色方法在庫爾勒香梨花絲細胞染色中的應用。