[發(fā)明專利]一種細(xì)胞源性質(zhì)控品的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510514774.0
• 申請(qǐng)日: 2015-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN105177124A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉昌軍;劉沛;朱柳;丁朋舉;李江浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京同輝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11357
• 代理人: 劉洪勛;郭麗英

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞系質(zhì)控品制備方法，具體講，涉及一種細(xì)胞源性質(zhì)控品的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)及分子生物學(xué)的發(fā)展，各種疾病診斷試劑盒也越來越多，隨著技術(shù)的成熟，其中的質(zhì)控品部分是檢測(cè)試劑盒非常重要的組成部分，特別是定量檢測(cè)試劑盒。目前市面上的試劑盒質(zhì)控品主要使用的是質(zhì)粒，質(zhì)粒適用范圍廣，幾乎所有的基因檢測(cè)類試劑盒質(zhì)控品均可選擇使用質(zhì)粒。但是質(zhì)粒制備不僅過程繁瑣，而且需要在-20℃下低溫儲(chǔ)存，隨著凍融次數(shù)增加，降解情況嚴(yán)重，穩(wěn)定性不好，給試劑盒質(zhì)控帶來諸多不便；同時(shí)質(zhì)粒作為一種質(zhì)控品，與待檢樣本同源性存在較大差異，特別是一些需要定量檢測(cè)的產(chǎn)品，用質(zhì)粒進(jìn)行定量不具有說服力；并且對(duì)于不同批次間的產(chǎn)品，也會(huì)由于質(zhì)粒的生產(chǎn)時(shí)間不同而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不同，給疾病檢測(cè)帶來諸多不便。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種細(xì)胞源性質(zhì)控品的制備方法；

本發(fā)明提供一種細(xì)胞源性質(zhì)控品在腫瘤基因突變檢測(cè)中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用技術(shù)方案的基本構(gòu)思是：一種細(xì)胞源質(zhì)控品的制備方法，包括如下步驟：

(1)、細(xì)胞的準(zhǔn)備

1)細(xì)胞的復(fù)蘇：提前備好42℃的溫水，按要求從液氮罐中取出對(duì)應(yīng)細(xì)胞凍存管，立即放入備好的溫水中快速搖動(dòng)，直至管中的液體恢復(fù)常溫。于超凈臺(tái)中將凍存管用質(zhì)量百分含量75％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液注入離心管中，再滴加5mL培養(yǎng)液。在1500r/min速度下離心5分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)皿中，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)。觀察生長(zhǎng)情況，若細(xì)胞密度較高，幾乎全部鋪滿皿底時(shí)及時(shí)進(jìn)行傳代。培養(yǎng)過程中嚴(yán)禁搖動(dòng)和來回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗；

2)細(xì)胞傳代培養(yǎng)：本步驟須在超凈臺(tái)中操作。取生長(zhǎng)適宜的培養(yǎng)細(xì)胞，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，沿皿壁加入2mL(視培養(yǎng)皿大小加入適量即可)的1xPBS輕輕清洗細(xì)胞，吸去PBS；再用PBS再清洗一次；

向培養(yǎng)皿中加入0.5mL的質(zhì)量百分含量為0.25％胰酶，輕輕搖晃培養(yǎng)皿使胰酶與皿底細(xì)胞充分接觸消化，1min后吸去胰酶，于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞基本恢復(fù)圓滑狀態(tài)，即可進(jìn)行下一步操作，若還有貼壁情況，則繼續(xù)消化直至細(xì)胞變得圓滑。注意胰酶消化時(shí)間過短過長(zhǎng)都不好，過短消化不完全，過長(zhǎng)可能對(duì)細(xì)胞膜造成一定損傷，都不利于細(xì)胞的繼續(xù)傳代；

向培養(yǎng)皿中加入3mL培養(yǎng)液(視培養(yǎng)大小加入適量即可)，用移液器將皿底細(xì)胞輕輕來回吹打混勻，顯微鏡下觀察細(xì)胞濃度，視細(xì)胞濃度向另一培養(yǎng)皿中加入600～1500μl的細(xì)胞懸浮液，并加入3mL培養(yǎng)液，用移液器輕輕吹打混勻，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度。注意步驟中的培養(yǎng)液及細(xì)胞懸浮液均可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行變動(dòng)；

置37℃溫箱靜置培養(yǎng)。觀察生長(zhǎng)情況，若細(xì)胞密度較高，幾乎全部鋪滿皿底時(shí)及時(shí)進(jìn)行傳代；

3)細(xì)胞的收集：貼壁生長(zhǎng)于培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，當(dāng)需要收集時(shí)，在用胰酶消化完全后可加入適量PBS，然后直接回收到離心管中。或者不加PBS直接收集胰酶消化的細(xì)胞。收集完畢的細(xì)胞可暫時(shí)放在0℃冰箱保存，長(zhǎng)時(shí)間不用的細(xì)胞最好保存在-80℃冰箱中備用；

(2)、細(xì)胞的石蠟包埋

1)細(xì)胞收集：將培養(yǎng)出的已經(jīng)計(jì)數(shù)好的細(xì)胞收集于離心管中，1500r/min離心5分鐘，棄上清；

2)細(xì)胞固定：向離心管中加入適量的質(zhì)量百分含量10％的中性福爾馬林，搖勻后斜放在4度冰箱中固定60分鐘，然后1500r/min離心5分鐘，棄上清；加入適量PBS清洗一次，1500r/min離心5分鐘，棄上清，保留少許PBS以用作混勻細(xì)胞；

3)細(xì)胞脫水：按照乙醇濃度從低到高的梯度進(jìn)行，每步脫水完成時(shí)1500r/min離心5分鐘，棄上清：50％乙醇30分鐘；

70％乙醇30分鐘；85％乙醇30分鐘；95％乙醇30分鐘；100％乙醇20分鐘；100％乙醇20分鐘；

4)石蠟包埋：在62℃環(huán)境下于通風(fēng)櫥中進(jìn)行操作，具體操作如下：1/2體積二甲苯加1/2體積的石蠟30分鐘，吸去二甲苯及石蠟；完全石蠟1小時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步包埋，待石蠟冷卻后對(duì)包埋的細(xì)胞塊進(jìn)行修剪，得到含有細(xì)胞的石蠟包埋塊；然后進(jìn)行二次包埋，用石蠟包埋1小時(shí)，降溫，待石蠟?zāi)碳纯伞?/p>

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述步驟(1)中2)細(xì)胞傳代培養(yǎng)和3)細(xì)胞的收集之間還包括細(xì)胞的凍存，具體步驟如下：