[發明專利]一種細胞源性質控品的制備方法

在審

• 申請號: 201510514774.0
• 申請日: 2015-08-20
• 公開（公告）號: CN105177124A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發明（設計）人: 劉昌軍;劉沛;朱柳;丁朋舉;李江浩
• 申請（專利權）人: 北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 劉洪勛;郭麗英

1.一種細胞源性質控品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)、細胞的準備

1)細胞的復蘇：從液氮罐中取出對應細胞凍存管，放入備好的42℃溫水中快速搖動，直至管中的液體恢復常溫；于超凈臺中將凍存管用質量百分含量75％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加5mL培養液，在1500r/min速度下離心5分鐘，棄去上層液，加入培養液后接種于培養皿中，置37℃溫箱靜置培養；

2)細胞傳代培養：于超凈臺中取復蘇的培養細胞，吸去培養皿中的培養液，沿皿壁加入2mL的1×PBS清洗細胞，吸去PBS，再用PBS清洗一次；

向培養皿中加入0.5mL的質量百分含量為0.25％胰酶，搖晃培養皿使胰酶與皿底細胞充分接觸消化，1min后吸去胰酶，于顯微鏡下觀察細胞狀態，至細胞基本恢復圓滑狀態；

向培養皿中加入3mL培養液，用移液器將皿底細胞來回吹打混勻，顯微鏡下觀察細胞濃度，視細胞濃度向另一培養皿中加入600～1500μl的細胞懸浮液，并加入3mL培養液，用移液器輕輕吹打混勻，顯微鏡下觀察細胞密度；

置37℃溫箱靜置培養，觀察生長情況；

3)細胞的收集：貼壁生長于培養皿中的細胞，用胰酶消化完全后直接回收到離心管中，收集完畢的細胞放在0℃冰箱保存；

(2)、細胞的石蠟包埋

1)細胞收集：將培養出的已經計數好的細胞收集于離心管中，1500r/min離心5分鐘，棄上清；

2)細胞固定：向離心管中加入質量百分含量10％的中性福爾馬林，搖勻后斜放在4度冰箱中固定60分鐘，然后1500r/min離心5分鐘，棄上清；加入適量PBS清洗一次，1500r/min離心5分鐘，棄上清，保留少許PBS以用作混勻細胞；

3)細胞脫水：按照乙醇濃度從低到高的梯度進行，每步脫水完成時1500r/min離心5分鐘，棄上清：50％乙醇30分鐘；

70％乙醇30分鐘；85％乙醇30分鐘；95％乙醇30分鐘；100％乙醇20分鐘；100％乙醇20分鐘；

4)石蠟包埋：在62℃環境下于通風櫥中進行操作，具體操作如下：1/2體積的二甲苯加1/2體積的石蠟30分鐘，吸去二甲苯及石蠟；完全石蠟1小時，對細胞進行初步包埋，待石蠟冷卻后對包埋的細胞塊進行修剪，得到含有細胞的石蠟包埋塊；然后進行二次包埋，用石蠟包埋1小時，降溫，待石蠟凝固即可。

2.如權利要求1所述的細胞源性質控品的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中2)細胞傳代培養和3)細胞的收集之間還包括細胞的凍存，具體步驟如下：

配制凍存液：按如下體積比例DMEM:FBS:DMSO＝7:2:1來配制凍存液，將細胞培養液、PBS、胰蛋白酶和凍存液溫浴到37℃；

凍存時的細胞要生長狀態好、生長旺的細胞，用細胞傳代方法消化細胞，用適量細胞培養液終止消化，重懸細胞；室溫200g離心10分鐘收集細胞，用凍存液重懸細胞，并調節濃度至約1×10⁶個細胞，4℃30min，轉到-20℃30min，再在-80℃過夜；將細胞轉入液氮中。

3.如權利要求1所述的細胞源性質控品的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中3)細胞脫水和4)石蠟包埋之間還包括：細胞透明，具體過程如下：用二甲苯逐步替代掉無水乙醇，在通風櫥中進行，具體操作如下：先以1/2體積的無水乙醇加1/2體積的二甲苯20分鐘，吸去上清；再1/3體積無水乙醇加2/3體積二甲苯20分鐘，吸去上清；然后換成二甲苯20分鐘，吸去二甲苯后即可進行細胞的石蠟包埋步驟。

4.如權利要求1所述的細胞源質控品的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的3)細胞的收集，具體為：貼壁生長于培養皿中的細胞，在用胰酶消化完全后可加入PBS，然后直接回收到離心管中。