[發明專利]一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法

有效

• 申請號: 201510514069.0
• 申請日: 2015-08-20
• 公開（公告）號: CN105052743B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 夏宜平;李丹青;王冠群;李康;馬怡迪
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 周世駿

技術領域

本發明是關于細胞工程組織培養技術領域，特別涉及一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法。

背景技術

黃菖蒲是鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)多年生濕生或挺水宿根植物，為水生花卉中的驕子，花姿秀美，葉色青翠，觀賞價值極高。此外黃菖蒲抗性強，可耐鹽堿，對水體中的重金屬離子和有機污染有一定的吸收能力，隨著城鄉水景建設的加快，其在城市水景中的使用量不斷增加。

盡管黃菖蒲具有很高的觀賞價值和生態適應性，但仍存在花色單一、單花花期過短等缺點。通過轉基因技術對植物性狀進行定向改造是一種較快的育種方式，尤其適用于觀賞植物新品種的培育。目前對鳶尾屬植物的遺傳轉化，大多是對其愈傷組織進行轉化，然后篩選、分化，從而獲得轉基因植株。因此，篩選出胚性良好的愈傷組織并使其具有較高的再生能力是最終獲得轉基因植株的關鍵環節。同時胚性愈傷組織還可用于植物種質資源保存與快繁生產中。

目前針對鳶尾屬植物愈傷組織的研究多集中于誘導階段，有關胚性愈傷組織的鑒定及胚性保持方法的報道和專利幾乎沒有。以幼葉和花器官作為外植體，誘導效率較低，且獲得的愈傷組織胚性較差，不易后期保存增殖，以莖尖為外植體時，由于根狀莖長期處于土壤環境中，攜帶病菌多，組培過程中消毒困難、污染率高，并且需要以損耗植物母體為代價。

植物組織誘導愈傷組織的能力，以及愈傷組織的分化再生能力，存在品種間、個體間的差異。隨著愈傷組織繼代時間增加，分化能力隨之下降。繼代一年的愈傷組織，幾乎不能再生出苗。這亦是轉基因研究的瓶頸之一。因此，探索一種污染率低，誘導率高、且能使胚性愈傷組織長期保持較高分化再生能力的方法，非常必要。

發明內容

本發明的主要目的在于克服現有技術中的不足，提供一種能有效保持黃菖蒲愈傷組織胚性，并使其能長期具有分化再生能力的方法。為解決上述技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，包括培養基的配置，所述有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法具體包括下述步驟：

(1)材料采取：

在黃菖蒲花期后50天，取(發育良好的)蒴果置于封口袋中，于4℃冰箱中冷藏4天；

將冷藏過的蒴果，在添加(少量)洗潔精和TWEEN-20的自來水中浸泡20min，再在流水下沖洗40min，然后在超凈工作臺上進行消毒處理；

(2)愈傷誘導培養：

將步驟(1)處理后的蒴果，放置在經高溫滅菌的濾紙上，用鑷子和解剖刀沿果實縱棱切開，取出顆粒飽滿的種子放于無菌濾紙上，剝取白色的嫩胚后接種至愈傷誘導培養基上；然后在培養室溫度為25攝氏度，黑暗條件下培養30天；

所述愈傷誘導培養基為含30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT(Kinetin，6-呋喃甲基腺嘌呤)和2.0mg/L 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)的MS培養基，且培養基溶液的pH值為5.85；

(3)胚性愈傷組織的篩選與保存：

外植體在愈傷誘導培養基上培養30天后，會出現胚性良好的愈傷組織，顏色金黃，顆粒致密，不發生褐化、水漬化、無根毛，從石蠟切片中可以看到，其細胞體積小，排列十分緊密，細胞核明顯，細胞含糖量豐富；同時，也會出現一些不能再生的非胚性愈傷組織或胚性較差的愈傷組織，顏色為淡黃色，外層有黏液，表現出水漬化，無明顯的顆粒狀結構，從切片中可以看出，其細胞較大，部分周緣細胞破碎，細胞與細胞之間空隙較大，多數無細胞核，細胞質少，細胞壁附近出現薄片狀糖類物質；

挑選質地緊密、顏色金黃的胚性愈傷組織團塊，接種于愈傷保存培養基上；待愈傷組織團塊平均直徑達到1cm以上后，將其切分為平均直徑為0.5cm的愈傷組織團塊后，再接種到新鮮的愈傷保存培養基上，繼代保存在25攝氏度、黑暗條件下進行，并每隔60天轉接一次(黃菖蒲愈傷組織保存)；

所述愈傷保存培養基為含30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、0～2.0mg/L 6-BA(6-Benzyladenine，6-芐氨基腺嘌呤)、0～2.0mg/L KT、0～2.0mg/L TDZ(Thidiazuron，噻重氮苯基脲)、0～2.0mg/L 2,4-D的MS培養基，且培養基溶液的pH值為5.8～5.9。

作為進一步的改進，所述步驟(1)中，所取的蒴果為長7～10cm的蒴果。