[發(fā)明專利]一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510514069.0 | 申請日： | 2015-08-20 |
| 公開（公告）號： | CN105052743B | 公開（公告）日： | 2017-06-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 夏宜平;李丹青;王冠群;李康;馬怡迪 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江大學(xué) |
| 主分類號： | A01H4/00 | 分類號： | A01H4/00 |
| 代理公司： | 杭州中成專利事務(wù)所有限公司33212 | 代理人： | 周世駿 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 有效 保存 菖蒲 胚性愈傷 組織 方法 | ||
1.一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，包括材料采取、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)、胚性愈傷組織的篩選與保存，其特征在于，所述有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法具體包括下述步驟：
(1)材料采?。?/p>
在黃菖蒲花期后50天，取蒴果置于封口袋中，于4℃冰箱中冷藏4天；
將冷藏過的蒴果，在添加洗潔精和TWEEN-20的自來水中浸泡20min，再在流水下沖洗40min，然后在超凈工作臺上進(jìn)行消毒處理；
(2)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)：
將步驟(1)處理后的蒴果，放置在經(jīng)高溫滅菌的濾紙上，用鑷子和解剖刀沿果實(shí)縱棱切開，取出顆粒飽滿的種子放于無菌濾紙上，剝?nèi)“咨哪叟吆蠼臃N至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；然后在培養(yǎng)室溫度為25攝氏度，黑暗條件下培養(yǎng)30天；
所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用添加有30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT和2.0mg/L2,4-D的MS培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基溶液的pH值為5.85；
(3)胚性愈傷組織的篩選與保存：
外植體在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天后，會(huì)出現(xiàn)胚性良好的愈傷組織，顏色金黃，顆粒致密，不發(fā)生褐化、水漬化、無根毛，從石蠟切片中可以看到，其細(xì)胞體積小，排列十分緊密，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞含糖量豐富；同時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)一些不能再生的非胚性愈傷組織或胚性較差的愈傷組織，顏色為淡黃色，外層有黏液，表現(xiàn)出水漬化，無明顯的顆粒狀結(jié)構(gòu)，從切片中可以看出，其細(xì)胞較大，部分周緣細(xì)胞破碎，細(xì)胞與細(xì)胞之間空隙較大，多數(shù)無細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞壁附近出現(xiàn)薄片狀糖類物質(zhì)；
挑選質(zhì)地緊密、顏色金黃的胚性愈傷組織團(tuán)塊，接種于愈傷保存培養(yǎng)基上；待愈傷組織團(tuán)塊平均直徑達(dá)到1cm以上后，將其切分為平均直徑為0.5cm的愈傷組織團(tuán)塊后，再接種到新鮮的愈傷保存培養(yǎng)基上，繼代保存在25攝氏度、黑暗條件下進(jìn)行，并每隔60天轉(zhuǎn)接一次；
所述愈傷保存培養(yǎng)基采用添加有30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、0～2.0mg/L 6-BA、0～2.0mg/L KT、0～2.0mg/L TDZ、0～2.0mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基溶液的pH值為5.8～5.9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所取的蒴果為長7～10cm的蒴果。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，消毒處理具體為：先將蒴果浸入體積濃度為70％的酒精溶液中，然后取出蒴果并置于酒精燈火焰上灼燒，直至蒴果表面酒精完全揮發(fā)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，嫩胚剝?nèi)〉姆椒ň唧w為：取出顆粒飽滿的種子放于無菌濾紙上，用手沿種子縱軸撕開，即能看到白色的嫩胚，為提高操作速度，先將撕開的種子放置于空的無菌培養(yǎng)皿中，撕開多個(gè)種子后統(tǒng)一用鑷子夾出嫩胚接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的愈傷保存培養(yǎng)基，采用添加有30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、0.1mg/L KT、2.0mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(3)篩選的胚性愈傷組織，還能用于遺傳轉(zhuǎn)化體系中，作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的受體，在再生培養(yǎng)基上分化生根，煉苗、移栽即能獲得黃菖蒲的轉(zhuǎn)基因植株。
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