[發明專利]一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法

有效

• 申請號: 201510514069.0
• 申請日: 2015-08-20
• 公開（公告）號: CN105052743B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 夏宜平;李丹青;王冠群;李康;馬怡迪
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司33212
• 代理人: 周世駿

1.一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，包括材料采取、愈傷誘導培養、胚性愈傷組織的篩選與保存，其特征在于，所述有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法具體包括下述步驟：

(1)材料采?。?/p>

在黃菖蒲花期后50天，取蒴果置于封口袋中，于4℃冰箱中冷藏4天；

將冷藏過的蒴果，在添加洗潔精和TWEEN-20的自來水中浸泡20min，再在流水下沖洗40min，然后在超凈工作臺上進行消毒處理；

(2)愈傷誘導培養：

將步驟(1)處理后的蒴果，放置在經高溫滅菌的濾紙上，用鑷子和解剖刀沿果實縱棱切開，取出顆粒飽滿的種子放于無菌濾紙上，剝取白色的嫩胚后接種至愈傷誘導培養基上；然后在培養室溫度為25攝氏度，黑暗條件下培養30天；

所述愈傷誘導培養基采用添加有30g/L蔗糖、3g/L Phytagel、0.2mg/L KT和2.0mg/L2,4-D的MS培養基，且培養基溶液的pH值為5.85；

(3)胚性愈傷組織的篩選與保存：

外植體在愈傷誘導培養基上培養30天后，會出現胚性良好的愈傷組織，顏色金黃，顆粒致密，不發生褐化、水漬化、無根毛，從石蠟切片中可以看到，其細胞體積小，排列十分緊密，細胞核明顯，細胞含糖量豐富；同時，也會出現一些不能再生的非胚性愈傷組織或胚性較差的愈傷組織，顏色為淡黃色，外層有黏液，表現出水漬化，無明顯的顆粒狀結構，從切片中可以看出，其細胞較大，部分周緣細胞破碎，細胞與細胞之間空隙較大，多數無細胞核，細胞質少，細胞壁附近出現薄片狀糖類物質；

挑選質地緊密、顏色金黃的胚性愈傷組織團塊，接種于愈傷保存培養基上；待愈傷組織團塊平均直徑達到1cm以上后，將其切分為平均直徑為0.5cm的愈傷組織團塊后，再接種到新鮮的愈傷保存培養基上，繼代保存在25攝氏度、黑暗條件下進行，并每隔60天轉接一次；

所述愈傷保存培養基采用添加有30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、0～2.0mg/L 6-BA、0～2.0mg/L KT、0～2.0mg/L TDZ、0～2.0mg/L 2,4-D的MS培養基，且培養基溶液的pH值為5.8～5.9。

2.根據權利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所取的蒴果為長7～10cm的蒴果。

3.根據權利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，消毒處理具體為：先將蒴果浸入體積濃度為70％的酒精溶液中，然后取出蒴果并置于酒精燈火焰上灼燒，直至蒴果表面酒精完全揮發。

4.根據權利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，嫩胚剝取的方法具體為：取出顆粒飽滿的種子放于無菌濾紙上，用手沿種子縱軸撕開，即能看到白色的嫩胚，為提高操作速度，先將撕開的種子放置于空的無菌培養皿中，撕開多個種子后統一用鑷子夾出嫩胚接種至愈傷誘導培養基上。

5.根據權利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的愈傷保存培養基，采用添加有30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、0.1mg/L KT、2.0mg/L 2,4-D的MS培養基。

6.根據權利要求1所述的一種有效保存黃菖蒲胚性愈傷組織的方法，其特征在于，所述步驟(3)篩選的胚性愈傷組織，還能用于遺傳轉化體系中，作為遺傳轉化體系的受體，在再生培養基上分化生根，煉苗、移栽即能獲得黃菖蒲的轉基因植株。