[發明專利]一種定點突變的大腸桿菌DNA光修復酶及其構建方法

有效

• 申請號: 201510511411.1
• 申請日: 2015-08-18
• 公開（公告）號: CN105087535B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 文斌;徐蕾;王鵬;朱國萍;田常青;曹正宇;黃士平
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 范奇

技術領域：

本發明涉及一種大腸桿菌光修復酶及其構建方法，特別屬于大腸桿菌DNA光修復酶及其構建方法。

背景技術：

由于人類活動造成的污染與破壞，使得大氣中的臭氧層愈發稀薄，陽光里的紫外光強度增加，對人類的傷害越來越大，特別是損傷細胞內部的DNA。紫外光破壞DNA的結構，會阻止DNA的正常復制和轉錄，會引起皮膚及組織細胞內的信號通路發生改變，造成免疫的抑制，皮膚的炎癥，在細胞內積累大量的CPD甚至造成皮膚癌(李沛波，關永源，賀華，丘欽英et al.中波段紫外線對角質形成細胞凋亡的誘導和鈣信號的影響[J].中國藥理學通報，2004,20(4)：398-402.)。這主要是由于紫外光造成DNA同一條鏈上的相鄰的胸腺嘧啶堿基產生環丁烷嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimer，CPD)，該光化學產物使DNA結構異常。

大腸桿菌DNA光修復酶在可見光作用下，能夠裂解還原環丁烷嘧啶二聚體，恢復DNA的正常結構。它是一種典型的環丁烷嘧啶二聚體光修復酶，通過特異性地結合在DNA的嘧啶二聚體上，專一吸收波長300-500nm的近紫外可見光，從而產生活性，將環丁烷嘧啶二聚體還原為兩個胸腺嘧啶，這是生物體利用光為驅動力來修復紫外線DNA損傷的重要途徑。現有的DNA光修復酶主要用于動物模型和人體實驗研究中，顯示其在修復基因損傷及阻止基因損傷誘導的生物學效應中具有重要作用，但現有的DNA光修復酶的穩定性比較差，抗氧化能力比較低。

發明內容：

本發明所解決的技術問第1個技術問題是提供穩定性好的一種定點突變的大腸桿菌DNA光修復酶。

本發明所要解決的第2個技術問題是上述光修復酶的構建方法。

本發明所要解決的第3個技術問題是提供上述變體基因編碼的光修復酶或包含上述變體基因的表達單元、重組質粒、或宿主細胞。

定點突變(site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis)是指通過在目的DNA片段(質粒，基因組)中某些目標位點引入特定的變化(包括堿基的添加，刪除，點突變等)。體外定點突變技術是研究蛋白功能與基因之間關系的主要手段，也是實驗室里優化基因的常用手段，為改造及優化蛋白質提供了有力的條件。通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法將某個目的基因的特定堿基突變(堿基缺失或者插入等)，從而改變翻譯出來的氨基酸序列，以及隨之折疊成的蛋白質的空間結構和發揮的功能，有利于分析蛋白質結構和功能的關系。

本發明從現有的WT大腸桿菌(Escherichia coli)中獲得DNA光修復酶基因(phr)，設計突變引物得到突變的基因片段，其編碼如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，連接突變基因片段與pET22b質粒，構建出重組表達質粒pET22b-A377N；將該重組質粒轉化到大腸桿菌感受態細胞，構建出用于突變體酶表達的基因工程菌BL21(DE3)/pET22b-A377N；在18℃和1mM ITPG條件下獲得了較好的表達。表達出的光修復酶活性更加穩定，而且酶的抗氧化效果顯著提高。

附圖說明:

圖1為phr基因的PCR擴增圖

M：DL2000；1：phr基因的PCR擴增產物

圖2為A377N片段PCR擴增圖

M：DL2000；2:A377N上游片段；3：A377N下游片段；

圖3為A377N融合PCR擴增圖

M：DL2000；4：A377N融合PCR產物。

圖4為實施例1所制的光修復酶純化的SDS-PAGE電泳圖

C為菌體總蛋白，P為菌體沉淀，S為破碎上清，E1-E3為純化蛋白分管收集樣品，PM為標準蛋白。

圖5為實施例1所制的光修復酶(A377N)及WT光修復酶的活性曲線

A377N：檢測的是第1、3、6、8、12、42天的酶活性變化

WT：檢測的是第1、3、5、6、11、41天的酶活性變化

圖6為實施例1所制的光修復酶(A377N)及WT光修復酶的450nm吸收峰變化曲線。

A377N：檢測的是第1、2、3、4、5、12、42天的450nm吸收峰的變化

WT：檢測的是1、2、3、4、5、6、11、41天的450nm吸收峰的變化