[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510498210.2
• 申請(qǐng)日: 2015-08-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105112348B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳敬;鄒純;段緒果
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/75;C12N9/44;C12R1/07
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建重組質(zhì)粒pulA/pSVEB，并轉(zhuǎn)化至短小芽孢桿菌Brevibacillus brevis(CCTCC AB94025)中，得到重組菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis。該菌株產(chǎn)普魯蘭酶的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl₂·6H₂O 12g/L。培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度30℃，pH為7.0。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了普魯蘭酶在短小芽孢桿菌中的胞外表達(dá)，3L罐發(fā)酵72h，發(fā)酵上清液酶活可達(dá)988.5U/mL。本工藝采用工業(yè)上常用的葡萄糖、棉籽粉、牛肉浸膏、無(wú)機(jī)鹽等原料進(jìn)行生產(chǎn)，簡(jiǎn)單易行，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

普魯蘭酶是一種能夠水解普魯蘭多糖、支鏈淀粉、α-極限糊精等分子中的α-1,6葡萄糖苷鍵的淀粉脫支酶。由于糖化酶等對(duì)糊精中的α-1，6-糖苷鍵水解效率很低，往往導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、副產(chǎn)物較多等問(wèn)題。而普魯蘭酶能快速切割糊精中的分支點(diǎn)，與糖化酶協(xié)同作用，可大幅度縮短反應(yīng)時(shí)間，提高原料的轉(zhuǎn)化率。因此被廣泛應(yīng)用于葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產(chǎn)品的生產(chǎn)中。

近年來(lái)，對(duì)于普魯蘭酶的開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。然而，大部分的研究局限于在大腸桿菌中表達(dá)。由于大腸桿菌是一種條件性致病菌，這就極大地限制了普魯蘭酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用。雖然也有一些研究者將普魯蘭酶在非致病菌中進(jìn)行表達(dá)，但表達(dá)量都很低。例如，張艷等將Bacillus naganoensis來(lái)源的普魯蘭酶克隆于枯草芽孢桿菌中，酶活為10.94U/mL，再經(jīng)劉逸寒等發(fā)酵優(yōu)化，酶活為20.16U/mL；謝銀珠等將Bacillusderamificans來(lái)源的普魯蘭酶克隆于地衣芽孢桿菌中，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化，酶活為1.5ASPU/mL。因此，實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶在非致病菌中過(guò)量表達(dá)，對(duì)普魯蘭酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有重大意義。

短小芽孢桿菌作為一種宿主菌表達(dá)異源蛋白，近年來(lái)受到了研究者的關(guān)注。首先，它是一種非致病菌，可應(yīng)用于食品工業(yè)；其次，它能過(guò)量合成活性異源蛋白，表達(dá)量可達(dá)1mg/mL以上；再次，它屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，只有一層細(xì)胞膜，蛋白的胞外分泌良好。此外，它還有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期較短等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于表達(dá)普魯蘭酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)普魯蘭酶的重組短小芽孢桿菌。

所述重組菌以短小芽孢桿菌為宿主，通過(guò)重組質(zhì)粒pulA/pSVEB表達(dá)來(lái)源于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶突變體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述普魯蘭酶是來(lái)源于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶(GenBank號(hào)為AX203845)的突變體。本發(fā)明以普魯蘭酶突變體為例進(jìn)行說(shuō)明，保護(hù)范圍不限于此。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述短小芽孢桿菌宿主為Brevibacillus brevisCCTCC AB94025。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組質(zhì)粒pulA/pSVEB是將缺失了啟動(dòng)子和信號(hào)肽的pWB980、普魯蘭酶表達(dá)元件、缺失了信號(hào)肽的pET20b(+)連接成環(huán)得到的；所述普魯蘭酶表達(dá)元件包括來(lái)源于短小芽孢桿菌的外壁蛋白啟動(dòng)子P2、外壁蛋白信號(hào)肽和來(lái)源于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶突變體基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述普魯蘭酶突變體的基因序列與CN201310610426.4中構(gòu)建的D437H/D503Y/d2突變體的序列一致，為N端的CBM41和X25兩個(gè)結(jié)構(gòu)域刪除了的且發(fā)生了D437H和D503Y突變的突變體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述普魯蘭酶表達(dá)元件的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。