[發明專利]一種異核苷或異核苷聯合2’-脫氧肌苷修飾的腱糖蛋白C核酸適配體GBI-10及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201510490310.0
• 申請日: 2015-08-11
• 公開（公告）號: CN105063055B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 楊振軍;李昆峰;鄧家荔
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C07H19/20;C07H19/173;C07H1/00;A61K31/7115;A61P35/00;G01N33/574
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司11139
• 代理人: 孫皓晨,韓小雷

技術領域

本發明涉及一種核酸適配體(aptamer)及其制備方法和應用方法，特別涉及一種異核苷或異核苷聯合2’-脫氧肌苷修飾的腱糖蛋白C核酸適配體GBI-10及其制備方法和應用。本發明屬于生物醫藥領域。

背景技術

Aptamer,即核酸適配體，源于拉丁語“aptus”,是由20-60個堿基組成的單鏈寡聚核苷酸(RNA)或單鏈寡聚脫氧核苷酸(DNA)。它能特異結合蛋白、小分子、離子和細胞等多種靶分子。核酸適配體于1990年由諾貝爾醫學獎獲得者Szostak和Gold等人發明，其具有很多抗體難以比擬的優勢。核酸適配體是通過SELEX技術篩選得到的，利用該技術可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶標高親和力結合的核酸適配體(Aptamer)。自Tuerk等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4 DNA聚合酶和有機染料分子的特異寡核苷酸配基后，經過二十幾年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研究手段和工具。

SELEX技術的基本原理是從一個化學合成的大容量寡核苷酸庫(RNA/DNA)中，結合PCR擴增，指數級富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過幾輪或數十輪篩選過程，獲得高親和力、高特異性的寡核苷酸配基，即適配體。SELEX的篩選主要包括以下幾個部分：(1)建庫：首先人工合成一個含10¹⁴-10¹⁵個單鏈寡核苷酸序列的隨機文庫。隨機文庫可以是RNA文庫,也可以是單鏈DNA文庫,一般隨機RNA文庫較為常用。單鏈寡核苷酸的序列兩端是帶有限制性內切酶位點的固定序列,中間是20-40個堿基的隨機序列。固定序列是為增加文庫的穩定性和為擴增做準備，此固定序列是PCR反應及其他酶學反應相關引物的結合位點。隨機序列不能太短,太短可能導致沒有足夠的二級結構同靶標分子結合,也不能太長,太長可能由于全套文庫單鏈寡核苷酸序列一定,導致降低了選擇分離出來的配基概率。(2)篩選：在特定的緩沖體系和選定溫度下,將所構建的隨機序列庫與靶標共同孵育，能與靶標進行結合的核酸會粘附在靶標上，與靶標無相互作用的核酸則會游離在緩沖體系中。(3)分離：將孵育后與靶標結合的核酸通過物理的方法分離出來。先通過透析及電泳等方法將與靶標結合及游離的核酸分離開，然后通過升溫等手段將與靶標結合的核酸與靶標分離開，得到初步能與靶標識別的核酸。(4)PCR擴增：將之前分離得到能與靶標結合的核酸進行PCR擴增。由于之前分離得到的核酸數目較少，無法滿足下一輪篩選的要求，因此需要進行PCR擴增，增加所篩選得到的核酸的數量。以篩選得到的核酸為模板，在核酸聚合酶的作用下以指數的形式增長，增加樣品的數量，以滿足下一輪的篩選。(5)再循環：通過PCR擴增得到數目充足的能與靶標結合的核酸后，重復之前的篩選工作，通過數輪甚至十幾輪的篩選后，既可得到與靶標進行高特異性，高親合力結合的核酸適配體。

理論上，通過SELEX篩選可以得到針對任何靶標的核酸適配體。利用SELEX篩選科學家篩選得到了一系列與人類疾病密切相關的核酸適配體，如針對HIV-1逆轉錄酶、血管內皮生長因子(VEGF)、核仁素、腱糖蛋白C(TN-C)、凝血酶、hnRNPA1蛋白等的核酸適配體。其中針對核仁素的核酸適配體AS1411已經完成二期臨床實驗，其對腎癌和非小細胞肺癌都有明顯的治療作用，因此開展對核酸適配體的研究工作具有非常重要的意義。

目前的核酸適配體絕大多數均是通過SELEX篩選得到。而SELEX過程中的四個重要步驟：建庫、篩選、分離、PCR擴增，對篩選是否成功都具有比較重要的影響。目前通過合理的設計篩選庫和優化分離方法能夠大大提高SELEX篩選的成功率。在SELEX篩選中PCR是比較重要的一個環節。在此環節中以篩選得到的核酸為模板，在DNA聚合酶的作用下進行擴增。在DNA的合成過程中，由于DNA聚合酶有比較強的選擇性，只能識別天然的A、G、C、T四種核苷酸，所以篩選得到的核酸適配體一般只是A、G、C、T的組合。對于一些理化性質更好的核苷類似物如UNA、LNA、2’-F-araN等，DNA聚合酶無法將其摻入到核酸適配體中。這種局限性限制了SELEX的應用。在對目前已經篩選得到的核酸適配體進行UNA、LNA、2’-F-araN、2’-O-methyl修飾發現，這些經過修飾的核酸適配體在一定程度上可以優化通過SELEX篩選到的核酸適配體的理化性質或提高核酸適配體的活性。