[發(fā)明專利]小鯢科動(dòng)物皮膚顯微組織切片的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510487750.0
• 申請(qǐng)日: 2015-08-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105241685B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊建利;劉秀英;孫原野;張亞男;胡益源;呂云云;孫平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南科技大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/06
• 分類號(hào): G01N1/06;G01N1/28
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司41119
• 代理人: 牛愛(ài)周

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種兩棲動(dòng)物皮膚顯微組織切片的制備方法，具體涉及用于顯微觀察的小鯢科動(dòng)物皮膚組織切片的制備方法，屬于顯微組織切片技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

皮膚是兩棲動(dòng)物機(jī)體的第一道天然屏障，在適應(yīng)和進(jìn)化的過(guò)程中，擔(dān)任了呼吸、調(diào)節(jié)水平衡、離子運(yùn)輸、抵抗獵食者、抗細(xì)菌、真菌等多方面的功能，這些功能體現(xiàn)了皮膚形態(tài)學(xué)特征的復(fù)雜性以及皮膚結(jié)構(gòu)潛在的生理特性，對(duì)維持兩棲動(dòng)物的生存、開(kāi)拓和適應(yīng)廣闊的棲息地以及多樣的生態(tài)環(huán)境中起著重要的作用。

小鯢科動(dòng)物是亞洲特有的有尾類兩棲動(dòng)物，也是現(xiàn)生有尾目10科中第三大科，全世界現(xiàn)已知66種，隸屬2亞科、10屬。中國(guó)現(xiàn)已知2亞科8屬30種，主要分布于東北、西南山區(qū)、華中及臺(tái)灣地區(qū)。小鯢科動(dòng)物生活環(huán)境可分為水棲型和陸棲型，由于生活環(huán)境導(dǎo)致不同生活環(huán)境的小鯢科動(dòng)物之間皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的差異，這些形態(tài)特征的差異為小鯢科動(dòng)物的適應(yīng)進(jìn)化研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；同時(shí)小鯢科動(dòng)物被認(rèn)為是有尾類中最原始的類群，故皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究可為兩棲動(dòng)物的進(jìn)化研究提供依據(jù)。故皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)特征在兩棲動(dòng)物中，特別是小鯢科動(dòng)物中的研究受到眾多學(xué)者的關(guān)注。

要研究皮膚的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，皮膚石蠟切片的制作是必不可少的一步。非專利文獻(xiàn)《小鯢科動(dòng)物外部形態(tài)特征和皮膚組織的形態(tài)學(xué)研究》(張向，2014)公開(kāi)了一種小鯢皮膚石蠟切片制作方法，包括：(1)取材：所采集的小鯢皮膚組織塊一般不宜過(guò)大，以(3～5mm)×(3～5mm)為宜，固定后流水沖洗24h；(2)脫水：依次放入70％乙醇2h、80％乙醇2h、85％乙醇1h、90％乙醇1h、95％乙醇1h、100％乙醇Ⅰ10min、100％乙醇Ⅱ10min；(3)透明：將脫水后的組織放入正丁醇Ⅰ15min，正丁醇Ⅱ15min進(jìn)行透明處理；(4)浸蠟：將皮膚組織放入石蠟Ⅰ浸蠟30min，再放入純石蠟Ⅱ浸蠟2h；(5)包埋：使用75℃左右的石蠟包埋；(6)切片：用單面刀片先將蠟塊四周修整平行并切成方形或長(zhǎng)方形，把蠟塊粘附在木塊上，調(diào)整刀片與石蠟切片約成5°角，切片厚度為4～6μm；(7)展片、貼片、干燥：將切好的組織片用毛筆卷起，慢慢平攤于44℃的溫水中進(jìn)行展片，然后用載玻片將切片挑起，放入烘烤箱中，烘片以玻片沒(méi)有明顯水漬為準(zhǔn)；(8)HE染色：將石蠟切片組織放入二甲苯15min、100％乙醇10min、95％乙醇5min、85％乙醇5min、75％乙醇5min、蒸餾水5min、蘇木素10min、流水沖洗5min、1％鹽酸酒精分色40s左右、流水沖洗藍(lán)化30min、70％乙醇2min、80％乙醇2min、伊紅乙醇5min、95％乙醇4min、100％乙醇4min，再放入二甲苯10min(共計(jì)1h58min)，然后用中性樹膠封片；(9)封固：在載玻片1/3處滴中性樹膠，用右手持細(xì)鑷輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，并把它的左邊放在樹膠的左邊，然后左手持解剖針?lè)鲎∩w玻片的左邊，右手將鑷子松開(kāi)逐漸下降，慢慢抽出，使樹膠在蓋玻片均勻地展開(kāi)并將其中氣泡排出，干燥，用二甲苯擦干凈蓋玻片周圍多余溢出的樹膠，即得。然而，該方法存在以下不足之處：(1)脫水不完全，造成石蠟滲透不完全，在切片時(shí)引起組織出現(xiàn)破碎或空洞，攤片時(shí)切片散開(kāi)，染色時(shí)托片和著色不良等；(2)正丁醇脫水效果不佳；(3)浸蠟過(guò)程由于缺乏過(guò)渡步驟，導(dǎo)致從透明步驟攜帶的二甲苯進(jìn)入石蠟中，從而造成石蠟濃度降低，另外浸蠟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成組織塊脆硬。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種小鯢科動(dòng)物皮膚顯微組織切片的制備方法，該方法可有效去除組織塊中的水分，防止石蠟滲透不全；提高透明效果，浸蠟時(shí)間相對(duì)縮短，可防止組織塊脆硬。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

小鯢科動(dòng)物皮膚顯微組織切片的制備方法，包括以下步驟：

(1)脫水：將經(jīng)固定處理的小鯢科動(dòng)物皮膚組織依次浸入濃度梯度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇中脫水，其中95％、100％乙醇各重復(fù)兩次，每個(gè)梯度脫水45～60min；

(2)透明：將經(jīng)脫水皮膚處理的組織浸入100％乙醇與二甲苯的混合液中2～3min，取出后再浸入二甲苯中10～30min；

(3)浸蠟：將經(jīng)透明處理的皮膚組織放入二甲苯與石蠟的混合液中20～30min，取出后再分兩次放入石蠟中，每次45～60min；

(4)將經(jīng)浸蠟處理的皮膚組織包埋，依次經(jīng)切片、展片、貼片、烤片、染色、封固處理，即得。