[發明專利]一種淀粉誘導型重組枯草芽孢桿菌及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201510486544.8
• 申請日: 2015-08-10
• 公開（公告）號: CN105039374B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 王騰飛;王瑞明;劉強
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12N15/75;C12N9/90;C12R1/125
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種淀粉誘導型重組枯草芽孢桿菌及其制備方法與應用，特別涉及一種淀粉誘導型重組枯草芽孢桿菌生產麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶及制造海藻糖的方法，屬于基因工程和酶工程技術領域。

背景技術

海藻糖是一種普遍存在的非還原性雙糖，由葡萄糖通過α-1,1糖苷鍵連接，其中α,α-1,1-海藻糖目前已被分離，并被發現廣泛存在于植物、動物及微生物中。天然的海藻糖對生物體或生物大分子具有較好的且非特異性的保護作用，可以使得具備海藻糖的生物體能夠度過饑餓、干燥、低溫、高溫、輻射等惡劣環境。隨著對海藻糖認知程度的增加，海藻糖在各方面的應用不斷得到拓展，在醫藥、食品、農業等領域得到廣泛推廣。

目前海藻糖的生產工藝主要有三種：

(1)提取法

提取法主要通過培養海藻糖含量較高天然生物來獲取，目前主要的提取對象為酵母(海藻糖含量約占酵母干重的15％)，但由于海藻糖屬于酵母內容物，提取時需要進行復制的破壁及分離提取工藝，因此目前逐漸被酶法制備海藻糖法取代。

(2)單酶法

單酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶轉化麥芽糖生產海藻糖的工藝。海藻糖合酶能夠將α,α-1,4-糖苷鍵連接的麥芽糖直接轉化為α,α-1,1-糖苷鍵連接的海藻糖，該轉化反應不需要磷酸鹽的存在，不需要消耗高能物質，但該方法所采用的酶熱穩定性一般較低，且轉化率多為60％左右，另外由于該酶同時具有輕微的水解活性，因此單酶法轉化過程中還會產生少量副產物的葡萄糖。

(3)雙酶法

雙酶法在1991年由Lama等人首次報道，即采用麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)兩種酶利用淀粉為底物生產海藻糖的方法。該方法中第一種酶用來催化聚合度(DP)大于3的麥芽糊精，轉化其還原端的α-1,4連接鍵生成α-1,1連接鍵。第二種酶專一性催化水解α-1,4鍵生成的α-1,1鍵海藻糖和低分子量的麥芽低聚糖。目前雙酶法多數以還原性淀粉為原料，轉化率多為70-80％左右，因此較單酶法相比更為經濟，除能夠生產海藻糖之外，還可以同時產生具有較高附加值的麥芽三糖，因此該工藝路線已被用于工業化生產。

雖然雙酶法具有以上諸多優點，但依然存在不足之處：雙酶法轉化所用兩種酶需要分別進行發酵及純化才能獲取，因此酶的生產成本明顯高于單酶法。

枯草芽孢桿菌啟動子是實現基因高效表達的關鍵元件之一。近年來，在啟動子的研究方面開展了大量的工作并取得了長足的進展，克隆獲得了一批可以應用于枯草芽孢桿菌的啟動子。但是，枯草芽孢桿菌的現有啟動子在數量、表達量和調控方式等方面存在著諸多問題。需要進一步研究和完善，獲得更多表達強度高，誘導調控方便的啟動子元件。

對于來自于解淀粉芽孢桿菌的PamyQ啟動子來說，用淀粉誘導目的蛋白產生，該淀粉誘導物即能夠誘導目的蛋白產生，反過來得到的目的蛋白酶以淀粉為底物直接轉化為海藻糖，增加了海藻糖合成的轉化率，對于制造海藻糖來說具有重要意義。同時PamyQ系統的誘導物淀粉相對于IPTG和木糖來說，價格便宜，成本低，且對細菌本身無毒性，因此在工業上很有實用價值。

發明內容

本發明主要針對現有技術的不足，提供一種淀粉誘導型重組枯草芽孢桿菌及其制備方法與應用。

本發明技術方案如下：

一種重組載體，其特征在于，在PHT43質粒的BamHI酶切位點前通過連續三次重疊PCR方式將Pgrac啟動子替換成α-淀粉酶啟動子PamyQ，然后在BamHI酶切位點后插入麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；

所述的α-淀粉酶啟動子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述重組質粒載體的制備方法，步驟如下：

(i)以穿梭質粒PHT43為模板，進行PCR擴增，得到PHT片段；

所述的PCR引物序列如下：

PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’

PHT-down:5’-CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3’