[發明專利]一種淀粉誘導型重組枯草芽孢桿菌及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201510486544.8
• 申請日: 2015-08-10
• 公開（公告）號: CN105039374B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 王騰飛;王瑞明;劉強
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12N15/75;C12N9/90;C12R1/125
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 朱家富

1.一種重組載體，其特征在于，在PHT43質粒的BamHI酶切位點前通過連續三次重疊PCR方式將Pgrac啟動子替換成α-淀粉酶啟動子PamyQ，然后在BamHI酶切位點后插入麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；

所述的α-淀粉酶啟動子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；麥芽寡糖基海藻糖合成酶-麥芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.權利要求1所述重組質粒載體的制備方法，其特征在于，步驟如下：

（i）以穿梭質粒PHT43為模板，進行PCR擴增，得到PHT片段；

所述的PCR引物序列如下：

PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’

PHT-down:5’-CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3’

所述的PCR擴增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物PHT-up 2.5μl，10μmol/L引物PHT-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（ii）提取 B. amyloliquefaciens菌體的DNA，以DNA為模板，進行PCR擴增，得到PamyQ片段；

所述的PCR引物序列如下:

PamyQ-up:5’-TTTTATCTTATCACGCCCCGCACATACGAA-3’

PamyQ-down:5’-TTCCTCCTTTAATTGGGAAGCACAAGTCTGAACGAAA-3’

所述的PCR擴增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物PamyQ-up 2.5μl，10μmol/L引物PamyQ-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸40sec，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（iii）以穿梭質粒PHT43為模板，進行PCR擴增，得到SamyQ片段；

所述的PCR引物序列如下:

SamyQ-up:5’-GTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGG-3’

SamyQ-down:5’-GGATCCTACGGCTGATGTTTTTGT-3’

所述的PCR擴增體系為50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物SamyQ-up 2.5μl，10μmol/L引物SamyQ-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH₂O補足50μl；

所述的PCR擴增程序如下：

95℃預變性5min；95℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（iv）將步驟（i）制得的PHT片段與步驟（ii）制得的PamyQ片段進行重疊PCR，制得PHT-PamyQ片段；

所述的重疊PCR的初次擴增體系為25μl：

PHT片段4μl； PamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，5個循環；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補充擴增體系為25μl：

上游引物PHT-up 2μl；下游引物PamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（v）將步驟（ii）制得的PamyQ片段與步驟（iii）制得的SamyQ片段進行重疊PCR，制得PamyQ-SamyQ片段；

所述的重疊PCR的初次擴增體系為25μl：

PamyQ片段4μl；SamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，5個循環；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補充擴增體系為25μl：

上游引物PamyQ-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（vi）將步驟（iv）制得的PHT-PamyQ片段與步驟（v）制得的PamyQ-SamyQ片段進行重疊PCR，制得PHT-PamyQ-SamyQ片段；

所述的重疊PCR的初次擴增體系為25μl：

PHT-PamyQ片段4μl；PamyQ-SamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH₂O 4.5μl；

所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，5個循環；72℃延伸2min；

所述的重疊PCR的補充擴增體系為25μl：

上游引物PHT-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（vii）將步驟（vi）制得的PHT-PamyQ-SamyQ片段連接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ；然后用限制性內切酶KpnI和BamHI對pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ和PHT43進行雙酶切，然后采用T4連接酶連接，制得重組質粒PamyQ-PHT43；

（viii）以Arthrobacter sp.L77基因組DNA為模板，分別設計擴增麥芽寡糖基海藻糖合成酶TreY的引物F1和R1、擴增麥芽寡糖基海藻糖水解酶TreZ 的引物F2和R2；

F1:5’-GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3’

R15’-CCTCGGGGGTGAACGTGC-3’

F2:5’-ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3’

R2:5’-GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3’

以Arthrobacter sp.L77基因組為模板，F1和R1為引物，通過PCR過程獲得產物TreY；

所述PCR體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板 2.5μl；ddH₂O 17.5μl；

所述PCR程序如下：

95℃變性5min；95℃變性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（ix）以Arthrobacter sp.L77基因組為模板，F2和R2為引物，通過PCR過程獲得產物TreZ;

所述PCR體系為50μl：

2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板 2.5μl；ddH₂O 17.5μl；

所述PCR程序如下：

95℃變性5min；95℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（x）將獲得的產物1和產物2通過重疊PCR方法實現兩基因間的拼接，得到產物TreY-TreZ；

所述的重疊PCR的初次擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5個循環；

所述的重疊PCR的補充擴增體系為25μl：

上游引物F1 2μl；下游引物R2 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH₂O 8.5μl；

所述的重疊PCR的補充擴增程序如下：

95℃預變性5min；94℃變性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸10min，-20℃保存；

（xi）將TreY-TreZ基因片段連接至pZERO-Blunt載體上，制得重組質粒pZERO-TreY-TreZ；用限制性內切酶BamHI和AatII對重組質粒pZERO-TreY-TreZ和步驟（vii）制得的重組質粒PamyQ-PHT43進行雙酶切，用T4連接酶進行連接，制得重組質粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ。