[發(fā)明專利]脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510476029.1
• 申請日: 2015-08-06
• 公開（公告）號: CN105028204B
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊茹薇;馮懷章;羅正乾;孫慧;徐琳黎;吳燕;古力米拉·熱合木土拉;朱榮貴;倪萌;李江濤;沈洪飛;馬靜
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆玉維鮮農(nóng)業(yè)科技中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 烏魯木齊合縱專利商標(biāo)事務(wù)所65105
• 代理人: 周星瑩,湯建武

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗早疫病材料篩選方法技術(shù)領(lǐng)域，是一種脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法。

背景技術(shù)

馬鈴薯是茄科茄屬的一年生草本塊莖植物，是重要的糧食、蔬菜兼用作物。由茄鏈格孢菌侵染引起的馬鈴薯早疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中嚴(yán)重的病害，在馬鈴薯各產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，并逐年加重趨勢。尤其在發(fā)展中國家被認(rèn)為是僅次于馬鈴薯晚疫病的第二大馬鈴薯病害。生產(chǎn)上對馬鈴薯晚疫病、病毒病的抗病性評價較多，而對早疫病研究較少。且現(xiàn)有早疫病的評價方法存在偏差大、檢測時間長和成本高，不適宜脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的評價。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決現(xiàn)有早疫病的評價方法存在偏差大、檢測時間長和成本高，不適宜脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的評價的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下措施來實現(xiàn)的：一種脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法，按下述步驟進(jìn)行：第一步，病原菌的分離，采集不同地區(qū)大田內(nèi)的馬鈴薯早疫病病葉，將馬鈴薯早疫病病葉采集后經(jīng)自來水沖洗1次至3次，沖洗后放入乙醇水溶液中浸泡20s至30s，浸泡后再放入升汞水溶液中浸泡10s至20s，用無菌水沖洗3遍至5遍，后用滅菌解剖刀取出病健交界的葉片，將病健交界的葉片背面朝上置于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿放入3片至4片葉片，置于25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3d至5d，培養(yǎng)后將葉片上的病原菌分離得到病原菌；

第二步，病原菌的純化，將分離后的病原菌置于25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2d至3d，挑選直徑為1cm至2cm的菌落鏡檢，確認(rèn)目標(biāo)菌落A，在目標(biāo)菌落A的邊緣挑取一小塊帶有菌絲的培養(yǎng)基再移接于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，直至菌落生長整齊一致無雜菌出現(xiàn)為止，即得到純化后的病原菌；

第三步，孢子囊懸濁液的制備，在無菌條件下，將純化后的病原菌接種至PDA平板培養(yǎng)基上常溫保存，在光照下培養(yǎng)14 d后生成孢子囊，在無菌條件下向PDA平板培養(yǎng)基上注入無菌蒸餾水沖洗過濾，過濾后收集孢子囊懸濁液，鏡檢并稀釋到6個孢子囊/100倍視野后得到孢子囊懸濁液；

第四步，接種，待不同品種的馬鈴薯脫毒試管苗長至7葉至8葉期時，挑選不同品種的馬鈴薯脫毒試管苗，每個品種分為處理組與對照組兩組，處理組隨機(jī)挑選60株至100株馬鈴薯脫毒試管苗，對照組隨機(jī)挑選60株至100株馬鈴薯脫毒試管苗，處理組在無菌環(huán)境下用移液槍吸取10ul孢子囊懸濁液接種在脫毒試管苗底部距培養(yǎng)基1cm至2cm的根莖處，對照組以接種10ul無菌水作為對照；接種后處理組和對照組馬鈴薯脫毒試管苗均置于光照為2000lx至3000lx、溫度為20℃至25℃的條件下觀察培養(yǎng)；待接種15d至20d后，當(dāng)接種后的馬鈴薯脫毒試管苗均表現(xiàn)為抗病時為具有抗早疫病的脫毒馬鈴薯試管苗。

下面是對上述發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)：

上述PDA培養(yǎng)基按下述方法得到：稱取200g新鮮馬鈴薯，洗凈去皮切片，加去離子水1000mL煮沸15min，紗布過濾后加去離子水補(bǔ)足至1000mL，再加12g葡萄糖和10g至12g瓊脂粉，煮沸待瓊脂粉完全熔化后得到PDA培養(yǎng)基。

上述病健交界的葉片大小為0.5cm²至1cm²。

上述乙醇水溶液為體積百分比為75%的乙醇水溶液。

上述升汞水溶液為質(zhì)量百分比為0.1%的升汞水溶液。

本發(fā)明脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法較傳統(tǒng)篩選方法誤差小、篩選時間短和篩選成本低；同時本發(fā)明脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法彌補(bǔ)了新疆地區(qū)在馬鈴薯早疫病研究及防治方面的空白，建立了一套適合新疆地區(qū)馬鈴薯抗早疫病試管苗的篩選方法，大大提高了早疫病鑒定的及時性、有效性及準(zhǔn)確性，在快速鑒定及防治疫病方面具有重要意義。

具體實施方式

本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實際情況來確定具體的實施方式。

實施例1，該脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法，按下述步驟進(jìn)行：第一步，病原菌的分離，采集不同地區(qū)大田內(nèi)的馬鈴薯早疫病病葉，將馬鈴薯早疫病病葉采集后經(jīng)自來水沖洗1次至3次，沖洗后放入乙醇水溶液中浸泡20s至30s，浸泡后再放入升汞水溶液中浸泡10s至20s，用無菌水沖洗3遍至5遍，后用滅菌解剖刀取出病健交界的葉片，將病健交界的葉片背面朝上置于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿放入3片至4片葉片，置于25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3d至5d，培養(yǎng)后將葉片上的病原菌分離得到病原菌；