[發明專利]脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法

有效

• 申請號: 201510476029.1
• 申請日: 2015-08-06
• 公開（公告）號: CN105028204B
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 楊茹薇;馮懷章;羅正乾;孫慧;徐琳黎;吳燕;古力米拉·熱合木土拉;朱榮貴;倪萌;李江濤;沈洪飛;馬靜
• 申請（專利權）人: 新疆玉維鮮農業科技中心
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 烏魯木齊合縱專利商標事務所65105
• 代理人: 周星瑩,湯建武

1.一種脫毒馬鈴薯試管苗抗早疫病的篩選方法，其特征在于按下述步驟進行：第一步，病原菌的分離，采集不同地區大田內的馬鈴薯早疫病病葉，將馬鈴薯早疫病病葉采集后經自來水沖洗1次至3次，沖洗后放入乙醇水溶液中浸泡20s至30s，浸泡后再放入升汞水溶液中浸泡10s至20s，用無菌水沖洗3遍至5遍，后用滅菌解剖刀取出病健交界的葉片，將病健交界的葉片背面朝上置于PDA平板培養基上，每皿放入3片至4片葉片，置于25℃的培養箱中黑暗培養3d至5d，培養后將葉片上的病原菌分離得到病原菌；

第二步，病原菌的純化，將分離后的病原菌置于25℃的培養箱中黑暗培養2d至3d，挑選直徑為1cm至2cm的菌落鏡檢，確認目標菌落A，在目標菌落A的邊緣挑取一小塊帶有菌絲的培養基再移接于PDA培養基上進行純化，直至菌落生長整齊一致無雜菌出現為止，即得到純化后的病原菌；

第三步，孢子囊懸濁液的制備，在無菌條件下，將純化后的病原菌接種至PDA平板培養基上常溫保存，在光照下培養14 d后生成孢子囊，在無菌條件下向PDA平板培養基上注入無菌蒸餾水沖洗過濾，過濾后收集孢子囊懸濁液，鏡檢并稀釋到6個孢子囊/100倍視野后得到孢子囊懸濁液；

第四步，接種，待不同品種的馬鈴薯脫毒試管苗長至7葉至8葉期時，挑選不同品種的馬鈴薯脫毒試管苗，每個品種分為處理組與對照組兩組，處理組隨機挑選60株至100株馬鈴薯脫毒試管苗，對照組隨機挑選60株至100株馬鈴薯脫毒試管苗，處理組在無菌環境下用移液槍吸取10ul孢子囊懸濁液接種在脫毒試管苗底部距培養基1cm至2cm的根莖處，對照組以接種10ul無菌水作為對照；接種后處理組和對照組馬鈴薯脫毒試管苗均置于光照為2000lx至3000lx、溫度為20℃至25℃的條件下觀察培養；待接種15d至20d后，當接種后的馬鈴薯脫毒試管苗均表現為抗病時為具有抗早疫病的脫毒馬鈴薯試管苗；

其中：

PDA培養基按下述方法得到：稱取200g新鮮馬鈴薯，洗凈去皮切片，加去離子水1000mL煮沸15min，紗布過濾后加去離子水補足至1000mL，再加12g葡萄糖和10g至12g瓊脂粉，煮沸待瓊脂粉完全熔化后得到PDA培養基；

病健交界的葉片大小為0.5cm²至1cm²；乙醇水溶液為體積百分比為75%的乙醇水溶液；升汞水溶液為質量百分比為0.1%的升汞水溶液。