[發(fā)明專利]一種豬捷申病毒通用型熒光定量RT-PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510471978.0
• 申請日: 2015-08-05
• 公開（公告）號: CN104962663A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張強;李樹清;王巧全;王艷;林穎崢;熊煒;李健
• 申請（專利權(quán)）人: 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動物疫病分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種豬捷申病毒的檢測方法，尤其涉及一種豬捷申病毒通用型熒光定量RT-PCR檢測方法。此外，本發(fā)明還涉及檢測豬捷申病毒的引物。

背景技術(shù)

豬捷申病毒(Porcine?Teschovirus，PTV)是小RNA病毒科(Picornaviridae)捷申病毒屬(Teschovirus)的成員，該病毒有13個血清型，在工業(yè)化豬場廣泛存在，不同的血清型會引起豬腦脊髓灰質(zhì)炎、繁殖障礙、肺炎、腹瀉、心包炎和心肌炎等臨床疾病，其中以1型病毒引起的高致病性、高死亡率的腦脊髓炎最為嚴(yán)重。該病毒可同其他病毒混合感染，協(xié)同作用，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，對豬群中病毒感染情況的檢測，是疫病預(yù)防控制、消除豬群間相互感染的重要措施。本發(fā)明利用Genbank中1～13型豬捷申病毒的全基因組，設(shè)計一套通用型的引物，達到快速準(zhǔn)確檢測捷申病毒的目的。

目前，對捷申病毒的檢測手段，主要是病毒分離鑒定和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。病毒分離鑒定是疫病診斷的經(jīng)典基礎(chǔ)方法，但也是最耗時的檢測手段，對于突發(fā)疫病的早期快速診斷無能為力，會延誤疫病確診和控制的時機。分子生物學(xué)的檢測方法已受到日益重視，RT-PCR已成為疫病診斷實驗室的常規(guī)檢測技術(shù)。特別是實時熒光定量PCR的出現(xiàn)，對于病原的檢測，大大提高了檢測方法的敏感性和特異性，實現(xiàn)了快速、精準(zhǔn)和可視化，同時實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍。

在本發(fā)明之前，還沒有出現(xiàn)涉及基于SYBR染料的豬捷申病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種通用型的高效、快速的豬捷申病毒熒光定量RT-PCR檢測方法，可用于口岸動物檢疫實驗室、各級獸醫(yī)診斷實驗室以及企業(yè)。為此，本發(fā)明還提供用于上述方法的檢測引物。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

在本發(fā)明的一方面，提供的是一種基于SYBR?Green?I實時熒光定量的通用型RT-PCR方法來檢測豬捷申病毒，包括下述操作步驟：

1)樣品處理：取組織樣品、糞便樣品或液體樣品，提取核酸；

2)設(shè)計引物，該引物序列為：

上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ?ID?NO.1所示)或其互補鏈；

下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ?ID?NO.2所示)或其互補鏈；

3)采用步驟2)設(shè)計的引物進行熒光定量RT-PCR檢測；

4)結(jié)果判定：根據(jù)擴增的曲線、Ct值和融解溫度確定檢測陽性和陰性。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟1)中，所述組織樣品處理步驟具體為：無菌取組織樣品，加入滅菌PBS，勻漿，取勻漿液提取核酸或-20℃保存?zhèn)溆茫凰黾S便樣品處理步驟具體為：取糞便，加入滅菌PBS，渦旋混勻，離心，取上清提取核酸；所述液體樣品處理步驟具體為：取液體樣品(例如血清等)直接進行核酸提取。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測的反應(yīng)體系為20μL，包括：2倍RT-PCR緩沖液10μL，反應(yīng)酶混合物0.8μL，ROX參比染料II?0.4μL，無RNase水5.2μL，同時加入步驟2)設(shè)計的10μmol/L濃度上下游引物各0.8μL和RNA模板2μL。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測的反應(yīng)體系在ABI7500或ViiA7熒光PCR檢測系統(tǒng)進行。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測的反應(yīng)條件為：

階段1為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃5min，95℃10sec；

階段II為PCR反應(yīng)：95℃5sec,56℃10sec，72℃30sec，72℃收集熒光，45個循環(huán)；

階段III為融解曲線分析：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec，ABI儀器自動生成。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟4)中，結(jié)果判定具體為：出現(xiàn)擴增曲線，Ct值小于38個循環(huán)且融解溫度為86.7±0.17℃范圍內(nèi)判定結(jié)果為陽性，否則判定結(jié)果為陰性。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測豬捷申病毒的引物，其序列為：

上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ?ID?NO.1所示)或其互補鏈；