[發明專利]一種豬捷申病毒通用型熒光定量RT-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 201510471978.0
• 申請日: 2015-08-05
• 公開（公告）號: CN104962663A
• 公開（公告）日: 2015-10-07
• 發明（設計）人: 張強;李樹清;王巧全;王艷;林穎崢;熊煒;李健
• 申請（專利權）人: 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種豬捷申病毒通用型熒光定量RT-PCR檢測方法，包括下述操作步驟：

1)樣品處理：取組織樣品、糞便樣品或液體樣品，提取核酸；

2)設計引物，該引物序列為：

上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ?ID?NO.1所示)或其互補鏈；

下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ?ID?NO.2所示)或其互補鏈；

3)采用步驟2)設計的引物進行熒光定量RT-PCR檢測；

4)結果判定：根據擴增的曲線、Ct值和融解溫度確定檢測陽性和陰性。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述組織樣品處理步驟具體為：無菌取組織樣品，加入滅菌PBS，勻漿，取勻漿液提取核酸或-20℃保存備用；所述糞便樣品處理步驟具體為：取糞便，加入滅菌PBS，渦旋混勻，離心，取上清提取核酸；所述液體樣品處理步驟具體為：取液體樣品直接進行核酸提取。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測的反應體系為20μL，包括：2倍RT-PCR緩沖液10μL，反應酶混合物0.8μL，ROX參比染料II?0.4μL，無RNase水5.2μL，同時加入步驟2)設計的10μmol/L濃度上下游引物各0.8μL和RNA模板2μL。

4.如權利要求1或3所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測的反應體系在ABI?7500或ViiA7熒光PCR檢測系統進行。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測的反應條件為：

階段1為反轉錄反應：42℃5min，95℃10sec；

階段II為PCR反應：95℃5sec,56℃10sec，72℃30sec，72℃收集熒光，45個循環；

階段III為融解曲線分析：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec，ABI儀器自動生成。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，結果判定具體為：出現擴增曲線，Ct值小于38個循環且融解溫度為86.7±0.17℃范圍內判定結果為陽性，否則判定結果為陰性。

7.一種用于檢測豬捷申病毒的引物，其特征在于，其序列為：

上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ?ID?NO.1所示)或其互補鏈；

下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ?ID?NO.2所示)或其互補鏈。