[發(fā)明專利]一種豬捷申病毒通用型熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510471978.0
• 申請(qǐng)日: 2015-08-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104962663A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-10-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張強(qiáng);李樹(shù)清;王巧全;王艷;林穎崢;熊煒;李健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種豬捷申病毒通用型熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，包括下述操作步驟：

1)樣品處理：取組織樣品、糞便樣品或液體樣品，提取核酸；

2)設(shè)計(jì)引物，該引物序列為：

上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ?ID?NO.1所示)或其互補(bǔ)鏈；

下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ?ID?NO.2所示)或其互補(bǔ)鏈；

3)采用步驟2)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)；

4)結(jié)果判定：根據(jù)擴(kuò)增的曲線、Ct值和融解溫度確定檢測(cè)陽(yáng)性和陰性。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述組織樣品處理步驟具體為：無(wú)菌取組織樣品，加入滅菌PBS，勻漿，取勻漿液提取核酸或-20℃保存?zhèn)溆茫凰黾S便樣品處理步驟具體為：取糞便，加入滅菌PBS，渦旋混勻，離心，取上清提取核酸；所述液體樣品處理步驟具體為：取液體樣品直接進(jìn)行核酸提取。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為20μL，包括：2倍RT-PCR緩沖液10μL，反應(yīng)酶混合物0.8μL，ROX參比染料II?0.4μL，無(wú)RNase水5.2μL，同時(shí)加入步驟2)設(shè)計(jì)的10μmol/L濃度上下游引物各0.8μL和RNA模板2μL。

4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系在ABI?7500或ViiA7熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述熒光定量RT-PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為：

階段1為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃5min，95℃10sec；

階段II為PCR反應(yīng)：95℃5sec,56℃10sec，72℃30sec，72℃收集熒光，45個(gè)循環(huán)；

階段III為融解曲線分析：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec，ABI儀器自動(dòng)生成。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，結(jié)果判定具體為：出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，Ct值小于38個(gè)循環(huán)且融解溫度為86.7±0.17℃范圍內(nèi)判定結(jié)果為陽(yáng)性，否則判定結(jié)果為陰性。

7.一種用于檢測(cè)豬捷申病毒的引物，其特征在于，其序列為：

上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ?ID?NO.1所示)或其互補(bǔ)鏈；

下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ?ID?NO.2所示)或其互補(bǔ)鏈。