[發(fā)明專利]一種猴子早期胚胎轉(zhuǎn)基因敲入的PCR鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510469573.3
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN105132535B
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳文鋒;楊宇豐;孫玲
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及基因工程領(lǐng)域，涉及一種猴子早期胚胎轉(zhuǎn)基因敲入的PCR鑒定方法。含有0.2?0.5μl培養(yǎng)基的單個注射完的早期胚胎收集于薄壁透明PCR管底部；用槍頭小心加入DLB裂解液5μl至PCR管底部，不要接觸到含有胚胎的培養(yǎng)基;置于冰上裂解15?30min釋放基因組DNA;裂解產(chǎn)物直接全部用于全基因組擴增反應(yīng)；然后用兩輪巢式PCR擴增方法進行轉(zhuǎn)基因敲入鑒定。本發(fā)明的方法能穩(wěn)定地對少至只有16個細胞的猴子單個胚胎進行操作，所有操作步驟一直在同一PCR管中操作，防止操作過程造成微量基因組的丟失。同時，高保真橫向擴增的方法拓展了基因組的下游應(yīng)用，按照此方法可穩(wěn)定、準確、簡便地實現(xiàn)對猴子單個胚胎基因組敲入的快速PCR鑒定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及基因工程領(lǐng)域，涉及一種猴子早期胚胎轉(zhuǎn)基因敲入的PCR鑒定方法。

背景技術(shù)

隨著全基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展完善以及大型基因組注釋項目的實施，生物科學(xué)的研究進入后基因組時代。在后基因組時代，基因組研究的重心將轉(zhuǎn)向基因功能，即由測定基因的DNA序列、解釋生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到從分子整體水平對生物學(xué)功能的研究上，在分子層面上探索人類健康和疾病的奧秘。科研人員們已經(jīng)開始通過各種嘗試，想要將基因組研究的成果盡早地運用到基礎(chǔ)科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，以及個性化醫(yī)療工作當(dāng)中。不過面對海量枯燥的基因組信息，科研人員們該如何將這些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成有意義的基因組功能？解決這個問題的一個很好方法是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對基因進行操作改造以實現(xiàn)研究基因功能的目的。

近十年來出現(xiàn)了一種新的研究手段，可以幫助科研人員對各種細胞和各種生物體內(nèi)的幾乎任意基因進行人工操作。這種新技術(shù)就是我們常說的“基因組編輯技術(shù)”，比如鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶、基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列和Cas蛋白的DNA核酸內(nèi)切酶等介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)。如圖1所示常見的基因組編輯方式，這些核酸酶能夠?qū)蚪M進行人工修飾，其基本原理是在靶位點區(qū)誘發(fā)DNA雙鏈缺口（double-strain breaks, DSBs），然后啟動非同源區(qū)的末端連接（NHEJ）DSB修復(fù)機制產(chǎn)生突變或是利用同源重組（HR）修復(fù)機制在同源模版存在的情況下完成我們所需要的各種人工修飾。

在轉(zhuǎn)基因操作實踐中，一般制造轉(zhuǎn)基因動物的流程是往受精卵中注入各種基因組編輯所需組分，然后體外培養(yǎng)數(shù)天至早期胚胎階段后移植進受體子宮中孕育產(chǎn)下后代。最后，取產(chǎn)下后代的局部組織進行基因組DNA提取并進行轉(zhuǎn)基因成功與否的鑒定。但是，在實際應(yīng)用中還存在有些情況需要在早期胚胎階段對轉(zhuǎn)基因成功與否進行鑒定。比如，預(yù)實驗需要體內(nèi)驗證所選的基因組編輯體系是否工作，為了縮短實驗時間，可以在注射完幾天的早期胚胎階段進行轉(zhuǎn)基因鑒定。特別是對于一些如猴子等非人靈長類動物來說，由于整個生殖周期較長，這種在早期胚胎進行鑒定的方法有很大的優(yōu)勢。