[發(fā)明專利]一種猴子早期胚胎轉(zhuǎn)基因敲入的PCR鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510469573.3
• 申請(qǐng)日: 2015-08-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105132535B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳文鋒;楊宇豐;孫玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種猴子早期胚胎轉(zhuǎn)基因敲入的PCR鑒定方法，其特征在于：含有0.2-0.5μl培養(yǎng)基的單個(gè)注射完的早期胚胎收集于薄壁透明PCR管底部；用槍頭小心加入DLB裂解液5 μl至PCR管底部，不要接觸到含有胚胎的培養(yǎng)基； 置于冰上裂解15-30min釋放基因組DNA; 裂解產(chǎn)物直接全部用于全基因組擴(kuò)增反應(yīng)；

第一輪PCR反應(yīng)體系：50 μl的反應(yīng)體系中加入5 μl 10xExTaq Buffer、4 μl的2.5 mMdNTPs，10 μM引物各1.5 μl，0.25 μl TaKaRa ExTaq，1 μl全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物，其余為無(wú)菌水；98℃預(yù)變性10s后進(jìn)入循環(huán)：98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸3min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min；取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；以第一輪PCR產(chǎn)物為模版，分別用引物IF1、IR1以及IF2、IR2進(jìn)行巢式第二輪PCR擴(kuò)增，鑒定轉(zhuǎn)基因敲入，PCR反應(yīng)體系如同第一輪，退火溫度為55℃，延伸時(shí)間為1min，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序鑒定；

設(shè)計(jì)左同源臂以外正向引物OF1及右同源臂以外反向引物OR2，以單個(gè)胚胎全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第一輪PCR，鑒定基因組質(zhì)量，同時(shí)對(duì)潛在的成功轉(zhuǎn)基因敲入片段進(jìn)行擴(kuò)增，其次設(shè)計(jì)左同源臂以外，OF1以內(nèi)的巢式正向引物IF1及插入片段上的反向引物IR1，以第一輪PCR產(chǎn)物為模版進(jìn)行左臂插入的鑒定，設(shè)計(jì)右同源臂以外，OR2以內(nèi)的巢式反向引物IR2及插入片段上的正向引物IF2，以第一輪PCR產(chǎn)物為模版進(jìn)行右臂插入的鑒定；

所述的OF1為5’-TTCACTTGGCTTGCACGATGTTT-3’，OR2為5’-GCCCTGACTTGCTGTTCCTGAG-3’； IF1為5’-TCACTCACATAGCAACCACCAGG-3’和IR1為5’-CGCCATAGTCCATAGGACCAGGA-3’，IF2為5’- ACATGGTCCTGCTGGAGTTCGT-3’和IR2為5’- CGCCTGTGTCAGTACACCTTGG-3’。