[發明專利]一種利用Tn7轉座元件整合表達外源蛋白的重組枯草芽孢桿菌構建方法

在審

• 申請號: 201510467499.1
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN105063078A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 周禮芹;蒙健宗;徐月梅;成春燕
• 申請（專利權）人: 南寧市新科健生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 王素娥

1.一種利用Tn7轉座元件整合表達外源蛋白的重組枯草芽孢桿菌構建方法，其特征在于：是通過構建一種用于在枯草芽孢桿菌的轉座整合質粒，插入外源蛋白基因及其表達元件后轉化枯草芽孢桿菌，通過誘導產生Tn7轉座酶TnsABCD，將外源蛋白基因及其表達元件轉座整合到枯草芽孢桿菌染色體glms基因下游3’端的attTn7位點；通過變溫培養，將培養溫度從26-30℃提高到33-37℃，使轉整合表達質粒上的溫度敏感復制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7轉座酶的轉座整合質粒的重組枯草芽孢桿菌；將菌落轉到不含抗生素的液體營養培養基上培養，能表達出活性蛋白質的菌株即為所需的轉座整合表達外源蛋白基因的重組枯草芽孢桿菌，所述的營養培養基是常規的發酵營養培養基，包括蛋白胨或水解蛋白1～50g/L，酵母提取物1～25g/L，氯化鈉1～15g/L。

2.根據權利要求1所述的一種利用Tn7轉座元件整合表達外源蛋白的重組枯草芽孢桿菌構建方法，其特征在于：利用Tn7轉座元件將外源蛋白基因及其表達元件轉座整合到枯草芽孢桿菌，該方法的步驟為：構建一種用于枯草芽孢桿菌的轉座整合質粒，插入外源蛋白基因及其表達元件后轉化枯草芽孢桿菌，通過誘導產生Tn7轉座酶TnsABCD，將外源蛋白基因及其表達元件轉座整合到枯草芽孢桿菌染色體glms基因下游3’端的attTn7位點；所述Tn7轉座酶TnsABCD是用來識別和剪切Tn7轉座片段、識別attTn7轉座位點和促使Tn7轉座片段插入到該位點。上述的Tn7轉座酶TnsABCD可以用阿拉伯糖操縱子，包括抑制子araC和啟動子Pbad來誘導表達，或用乳糖操縱子，包括阻遏基因lacI，操縱基因lacO和啟動子lacP來誘導表達；

所述用于枯草芽孢桿菌的轉座整合質粒，包含有下列組分：能在大腸桿菌中復制質粒的復制子和能在枯草芽孢桿菌中復制質粒的溫敏復制子，含有抗生素抗性基因、轉座子Tn7左右臂盒子、多克隆位點、Tn7轉座酶TnsABCD片段及其誘導表達元件；

所述能在大腸桿菌中復制質粒的復制子是pBR322ori，或colE1ori；所述可用于枯草芽孢桿菌中復制質粒的溫敏復制子是pWV01ori/ts，其特點是在28℃左右可以行使復制功能，但在35℃左右時失去復制能力；

所述可在枯草芽孢桿菌中使用的抗生素抗性基因是氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、紅霉素抗性基因或壯觀霉素抗性基因，該抗生素抗性基因克隆于Tn7左臂和右臂之外，在轉座重組時不會被轉座整合到枯草芽孢桿菌染色體上；

所述的用于枯草芽孢桿菌轉座整合表達的外源蛋白基因，是酶、抗菌肽活性蛋白質基因；所述的外源蛋白基因的表達元件，包括以下組分：能在枯草芽孢桿菌中高效轉錄的啟動子如P43啟動子，或Pamy啟動子；高效分泌的信號肽片段如sacB信號肽片段，或amyQ信號肽片段；所述的外源蛋白基因及其表達元件克隆于Tn7左臂和右臂之間的多克隆位點；

所述的用于轉座整合的枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌168衍生菌株如1A751，WB600，WB800。