[發明專利]一種利用Tn7轉座元件整合表達外源蛋白的重組枯草芽孢桿菌構建方法

在審

• 申請號: 201510467499.1
• 申請日: 2015-08-03
• 公開（公告）號: CN105063078A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 周禮芹;蒙健宗;徐月梅;成春燕
• 申請（專利權）人: 南寧市新科健生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 王素娥

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是一種利用Tn7轉座元件整合表達外源蛋白的重組枯草芽孢桿菌構建方法。

背景技術

在食品和藥品用活性蛋白質的生產中，采用基因工程技術對活性蛋白質基因進行異源表達已經被證明是提高產量和純度的有效方法。作為常用的基因工程宿主菌，大腸桿菌生長繁殖迅速，培養簡單，發酵成本較低，也沒有復雜的蛋白酶系，重組蛋白較穩定，因而成為生產重組蛋白質的良好宿主。但大腸桿菌用于生產食品工業用酶仍存在一些缺陷，主要有：1.大腸桿菌不是公認為安全的菌株；2.在重組大腸桿菌的高密度發酵中，表達質粒往往由于結構不穩定性和分離不穩定性而易于丟失。為了保持重組大腸桿菌表達質粒的遺傳穩定性，往往需要施加選擇壓力，目前最常用的選擇壓力是添加抗生素。添加抗生素選擇壓力無疑會增加菌體的代謝負荷，增加生產成本，引起終產品中抗生素殘留，引起抗性基因在環境中的擴散。對于食品和藥物用重組蛋白質，產品中殘留抗生素已逐漸被世界各國禁止。

公認為安全的微生物主要有真菌中的曲霉菌和酵母菌、細菌中的乳酸菌和枯草芽孢桿菌等，其中天然枯草芽孢桿菌在食品工業中已有悠久的應用歷史，人們對其遺傳背景和生理特性的了解僅次于大腸桿菌；重組枯草芽孢桿菌生長速度較真菌快得多，能將酶蛋白分泌到細胞外，無需細胞破碎，分離純化工藝簡便，并且表達產物可溶，可正確折疊，并具有生物活性；因此采用枯草芽孢桿菌整合表達食品用活性蛋白質基因是較好的選擇。整合的外源基因隨枯草芽孢桿菌染色體DNA的復制而復制，在大多數情況下相當穩定，重組菌在不使用抗生素選擇壓力下可以連續傳代培養而不丟失基因表達盒，可從源頭上解決抗生素問題，這對生產食品用活性蛋白質產品十分有意義。

將外源基因整合到染色體上可采用同源重組和轉座重組的方法，傳統的RecA和λRed同源重組系統重組發生的頻率較低，操作繁瑣，但也可構建單拷貝的整合表達枯草芽孢桿菌和更多拷貝的整合表達枯草芽孢桿菌(李曉明等，一種以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產a-乙酰乳酸脫羧酶的方法，專利號ZL201010271749.1；李曉明等，一種在枯草芽孢桿菌中以整合型的方式重組表達β-淀粉酶的方法，專利號ZL201010563646.2；廖東慶等，將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體同一個整合位點的方法，專利號ZL201010563647.7)。同源重組整合存在的缺點是仍然需要在所整合的DNA片段中保留抗生素基因，以便篩選出同源交換產生的重組子。而與同源重組法相比，轉座重組不需要將抗生素抗性基因整合到枯草芽孢桿菌染色體，并且可以將含有抗性基因和轉座酶的整合質粒驅除出宿主菌，得到遺傳穩定的外源基因整合表達。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用Tn7轉座元件整合表達外源蛋白的重組枯草芽孢桿菌構建方法，以解決同源重組整合仍然需要在整合片段中保留抗生素基因的問題。

本發明達到上述目的的技術方案如下：

1.一種利用Tn7轉座元件整合表達外源蛋白的重組枯草芽孢桿菌構建方法是通過構建一種用于在枯草芽孢桿菌的轉座整合質粒，插入外源蛋白基因及其表達元件后轉化枯草芽孢桿菌，通過誘導產生Tn7轉座酶TnsABCD，將外源蛋白基因及其表達元件轉座整合到枯草芽孢桿菌染色體glms基因下游3’端的attTn7位點；然后通過變溫培養，將培養溫度從26～30℃提高到33～37℃，使轉整合表達質粒上的溫度敏感復制子失去作用，得到不再保留含有抗生素抗性基因和Tn7轉座酶的轉座整合質粒的重組枯草芽孢桿菌。將菌落轉到不含抗生素的液體營養培養基上培養，能表達出活性蛋白質的菌株即為所需的轉座整合表達外源蛋白基因的重組枯草芽孢桿菌。

上述的營養培養基是常規的發酵營養培養基，包括蛋白胨或水解蛋白1～50g/L，酵母提取物1～25g/L，氯化鈉1～15g/L。

2.利用Tn7轉座元件將外源蛋白基因及其表達元件轉座整合到枯草芽孢桿菌，該方法的步驟為：構建一種用于枯草芽孢桿菌的轉座整合質粒，插入外源蛋白基因及其表達元件后轉化枯草芽孢桿菌，通過誘導產生Tn7轉座酶TnsABCD，將外源蛋白基因及其表達元件轉座整合到枯草芽孢桿菌染色體glms基因下游3’端的attTn7位點。

上述用于枯草芽孢桿菌的轉座整合質粒，包含有下列組分：能在大腸桿菌中復制質粒的復制子和能在枯草芽孢桿菌中復制質粒的溫敏復制子，含有抗生素抗性基因、轉座子Tn7左右臂盒子、多克隆位點、Tn7轉座酶TnsABCD片段及其誘導表達元件。