[發明專利]一組用于口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探針

在審

• 申請號: 201510460288.5
• 申請日: 2015-07-31
• 公開（公告）號: CN105063191A
• 公開（公告）日: 2015-11-18
• 發明（設計）人: 車團結;徐進章;李亞鵬;李琳;尤崇革;謝小冬;常運朝
• 申請（專利權）人: 蘇州百源基因技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 閆艷艷

技術領域

本發明屬于微生物檢測方法技術領域，具體涉及一組用于口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探針。

背景技術

1983年，幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，簡稱Hp)被澳大利亞的Warren和Warshail發現，引起了大量學者的關注。Krajden于1989年首次從胃炎患者牙菌斑中分離培養出Hp，幽門螺桿菌感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃腺癌、胃粘膜相關性淋巴瘤有著密切的聯系。大量學者研究發現患有消化性疾病患者口腔Hp與其胃粘膜內的形態學和生物學特征相似，具有同源性。

以前大量的研究都集中在胃部的幽門螺桿菌。但是唾液、口腔潰瘍、舌背、口腔腫瘤中也存在大量的Hp，口腔是Hp胃外重要的儲存場所，口腔有可能是胃內Hp感染和復發的來源。因此研究口腔中Hp的感染情況具有重要的臨床意義。Song等認為，Hp作為條件致病菌，可存在于健康人和消化道疾病患者的口腔內，當環境改變時會導致疾病的發生。同時我們可以推測,如果口腔內Hp可以根除、口腔健康可以很好改善,胃內Hp感染可能更容易預防、徹底根除。

流行病學調查顯示，Hp感染在世界各地均較為常見，具有很高的發病率，因此迫切需要一種快速、特異的檢測方法。目前診斷Hp感染的方法很多，包括尿素酶檢測、細菌培養、組織學染色、血清Hp抗體檢測等，而針對口腔Hp的診斷檢測方法并不多。Hp可產生大量的尿素酶，利用尿素酶試驗可檢測口腔內Hp，口腔內有多種細菌尿素酶陽性，如唾液鏈球菌等，容易產生假陽性，特異性低，因此此種方法的應用難以讓人信服。細菌的分離培養是檢測Hp的金標準,且可進行藥敏試驗，指導臨床用藥，但是口腔內Hp的數量較少且口腔菌群復雜，微生物種類多，檢測敏感性低，陽性檢出率低。PCR技術作為一種分子生物學工具，可以選擇性體外擴增DNA或RNA片段，特異性強、敏感性高，用于牙菌斑、唾液Hp的檢測，不受菌量少、是否為活菌的因素影響，已廣泛應用于臨床和科研。近年來發展起來的實時熒光定量PCR（FluorescencequantitativePCR）技術從常規PCR定性檢測邁上量化的臺階，實現了PCR技術從定性到定量的飛躍，避免了傳統PCR定量鑒定中交叉污染的問題，它相對于常規PCR技術先進、操作簡便，實現了實時監測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點。

發明內容

本發明目的在于設計一組用于定量測定口腔中幽門螺桿菌含量的特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應用于幽門螺桿菌檢測的快速、靈敏、特異性好的熒光定量PCR檢測的方法。本發明采用基因克隆技術，將幽門螺桿菌16S核糖體RNA基因（16srRNA）片段插入到載體pMD18-T中，獲得含有16srRNA基因片段的重組質粒，以此作為標準品。根據幽門螺桿菌16srRNA的基因片段編碼基因序列設計并合成一組特異性引物和探針，優化PCR反應條件，建立以實時熒光定量聚合酶鏈反應為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進行評估。

本發明提供一組用于口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探針，所述特異性引物和探針的核苷酸序列為（1）-（3）中的一種：

（1）、上游引物：5'-TGGCGCACGGGTGAGT-3'；

下游引物：5'-CCAATGGCTATCCCAAACTAAGA-3'；

探針：5'-ACGCATAGGTCATGTGC-3'；

所述引物和探針擴增的目標核苷酸序列參見序列表中SEQIDNo.2；

（2）、與（1）所述序列互補的序列；

（3）、將（1）中所述序列向5’端和3’端方向延伸一至數個堿基或刪減一至數個堿基得到的序列。

經實驗驗證，將（1）中所述序列向5’端和3’端方向延伸一至數個堿基或刪減一至數個堿基得到的序列也能很好的擴增上述目標核苷酸序列。

優選地，所述探針的5’端熒光報告基團是FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端標記的是熒光淬滅基團TAMRA、DABCYL或BHQ。

本發明還提供口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物和探針。

本發明的第三個目的是提供上述特異性引物和探針、試劑盒在定量檢測口腔中幽門螺桿菌含量中的應用。

本發明的第四個目的是提供口腔中幽門螺桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，步驟如下：