[發明專利]一種結合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法

有效

• 申請號: 201510454904.6
• 申請日: 2015-07-29
• 公開（公告）號: CN104982419B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 楊春艷;尚江華;鄭海英;谷毅鵬;黃芬香;梁賢威;黃鋒;陳明棠;覃廣勝
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水牛研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司11129
• 代理人: 張濤

1.一種結合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，其特征在于：所述方法為將水牛體外生產的胚胎培養至擴張囊胚，用激光破膜儀將囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷凍液進行玻璃化冷凍。

2.根據權利要求1所述的結合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，其特征在于：所述冷凍液由以下材料組成：濃度為20％的乙二醇(EG)溶液，濃度為20％的二甲基亞砜(DMSO)溶液，濃度為0.5M的蔗糖溶液。

3.根據權利要求1所述的結合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

(1)采用XYClone激光破膜系統，調整參數至90％脈沖強度，800μs的脈沖寬度，在囊胚內細胞團對面的透明帶上作15-20μm的透明帶切口，并擊破囊胚腔使囊胚液流出；

(2)取0.25mL塑料麥管在其一端用刀片作一30°的斜切面，用作水牛胚胎超低溫冷凍載體；

(3)將處理好的胚胎轉入經室溫平衡后的冷凍平衡液內保持5min，而后轉入冷凍液內清洗2-3次，吸取囊胚混合少量冷凍液(小于1μL)放置于麥管斜切面的尖部，直接投入液氮保存；

(4)從液氮罐內取出超低溫冷凍保存的胚胎，直接浸入經室溫平衡的解凍液內，晃動麥管，在顯微鏡下見囊胚脫出即可，囊胚在解凍液內停留5min，而后用CM液(胚胎培養液)清洗2-3次，轉入覆蓋石蠟油的40-50μL?CM微液內，38.5℃、5％CO₂及飽和濕度的條件下培養使其復蘇。

4.根據權利要求3所述的結合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，其特征在于：所述冷凍液、冷凍平衡液、解凍液均采用TCM199和10％胎牛血清(FBS)混合溶液作為基礎液。

5.根據權利要求3所述的結合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，其特征在于：所述冷凍平衡液由以下材料組成：濃度為20％的EG溶液，濃度為5％的DMSO溶液。

6.根據權利要求3所述的結合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，其特征在于：所述解凍液由以下材料組成：濃度為0.5M的蔗糖溶液。