[發(fā)明專利]一種結(jié)合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510454904.6
• 申請日: 2015-07-29
• 公開（公告）號: CN104982419B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊春艷;尚江華;鄭海英;谷毅鵬;黃芬香;梁賢威;黃鋒;陳明棠;覃廣勝
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)水牛研究所
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11129
• 代理人: 張濤

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種結(jié)合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法。

【背景技術(shù)】

水牛體外生產(chǎn)胚胎對低溫敏感且冷凍效率低，主要是由于體外培養(yǎng)條件不當造成胚胎質(zhì)量不佳以及胚胎內(nèi)脂滴多造成。對于水牛胚胎的超低溫冷凍，如今主要采用玻璃化冷凍法，但是對于胚胎冷凍階段、冷凍液和冷凍程序都沒有統(tǒng)一的標準。而且水牛胚胎在冷凍前都未經(jīng)任何處理，因此冷凍效率仍然較低，特別對于8-9d的囊胚而言，其冷凍效率僅為50-60％。此外，由于玻璃化冷凍-解凍后，胚胎的透明帶厚度平均會增加2.8μm，冷凍后的胚胎孵化率也僅為50％左右，從而造成解凍胚胎移植后的受胎率僅為4-12％。因此需要發(fā)展一種冷凍手段保證水牛胚胎的冷凍效率，同時提高冷凍-解凍后胚胎的孵化率和移植受胎率。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明提供一種結(jié)合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，可提高胚胎的冷凍存活率和移植受胎率。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種結(jié)合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，所述方法為將水牛體外生產(chǎn)的胚胎培養(yǎng)至擴張囊胚，用激光破膜儀將囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷凍液進行玻璃化冷凍。

進一步地，所述冷凍液由以下材料組成：濃度為20％的乙二醇(EG)溶液，濃度為20％的二甲基亞砜(DMSO)溶液，濃度為0.5M的蔗糖溶液。

進一步地，所述方法包括以下步驟：

(1)采用XYClone激光破膜系統(tǒng)，調(diào)整參數(shù)至90％脈沖強度，800μs的脈沖寬度，在囊胚內(nèi)細胞團對面的透明帶上作15-20μm的透明帶切口，并擊破囊胚腔使囊胚液流出；

(2)取0.25mL塑料麥管在其一端用刀片作一30°的斜切面，用作水牛胚胎超低溫冷凍載體；

(3)將處理好的胚胎轉(zhuǎn)入經(jīng)室溫平衡后的冷凍平衡液內(nèi)保持5min，而后轉(zhuǎn)入冷凍液內(nèi)清洗2-3次，吸取囊胚混合少量冷凍液(小于1μL)放置于麥管斜切面的尖部，直接投入液氮保存；

(4)從液氮罐內(nèi)取出超低溫冷凍保存的胚胎，直接浸入經(jīng)室溫平衡的解凍液內(nèi)，晃動麥管，在顯微鏡下見囊胚脫出即可，囊胚在解凍液內(nèi)停留5min，而后用CM液(胚胎培養(yǎng)液)清洗2-3次，轉(zhuǎn)入覆蓋石蠟油的40-50μL?CM微液內(nèi)，38.5℃、5％CO₂及飽和濕度的條件下培養(yǎng)使其復(fù)蘇。

進一步地，所述冷凍液、冷凍平衡液、解凍液均采用TCM199和10％胎牛血清(FBS)混合溶液作為基礎(chǔ)液。

進一步地，所述冷凍平衡液由以下材料組成：濃度為20％的EG溶液，濃度為5％的DMSO溶液。

進一步地，所述解凍液由以下材料組成：濃度為0.5M的蔗糖溶液。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明在冷凍前將囊胚液排出，可使冷凍保護液更快速的進入胚胎，且減少了細胞內(nèi)冰晶形成的可能性，從而很大程度上避免了胚胎損傷，可提高胚胎的冷凍存活率。另一方面，由于在冷凍前就將透明帶進行了部分破除，因此在解凍培養(yǎng)后，可使復(fù)蘇的囊胚腔更易孵出透明帶，從而利于胚胎移植后在子宮內(nèi)的著床，提高移植受胎率。

【具體實施方式】

下面結(jié)合具體的實施例來進一步說明本發(fā)明，但并不以此來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

一種結(jié)合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法，所述方法為將水牛體外生產(chǎn)的胚胎培養(yǎng)至擴張囊胚，用激光破膜儀將囊胚腔打孔，排出囊胚液，然后用冷凍液進行玻璃化冷凍。在本實施方式中，所述冷凍液由以下材料組成：濃度為20％的乙二醇(EG)溶液，濃度為20％的二甲基亞砜(DMSO)溶液，濃度為0.5M的蔗糖溶液。進一步地，所述結(jié)合激光破膜的水牛胚胎冷凍方法還包括以下步驟：

(1)采用XYClone激光破膜系統(tǒng)，調(diào)整參數(shù)至90％脈沖強度，800μs的脈沖寬度，在囊胚的內(nèi)細胞團對面的透明帶上作15-20μm的透明帶切口，并擊破囊胚腔使囊胚液流出。

(2)取0.25mL塑料麥管在其一端用刀片作一30°的斜切面，用作水牛胚胎超低溫冷凍載體。

(3)將處理好的胚胎轉(zhuǎn)入經(jīng)室溫平衡后的冷凍平衡液內(nèi)保持5min，而后轉(zhuǎn)入冷凍液內(nèi)清洗后，吸取囊胚混合少量冷凍液(小于1μL)放置于麥管斜切面的尖部，直接投入液氮保存。在本實施方式中，所述冷凍平衡液、冷凍液與解凍液均采用TCM199+10％胎牛血清(FBS)混合液作為基礎(chǔ)液；所述冷凍平衡液由以下材料組成：濃度為20％的EG溶液，濃度為5％的DMSO溶液。