[發明專利]一種土壤中殘留bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法

有效

• 申請號: 201510452807.3
• 申請日: 2015-07-28
• 公開（公告）號: CN105137061A
• 公開（公告）日: 2015-12-09
• 發明（設計）人: 方志翔;劉標;沈文靜;李衍亮
• 申請（專利權）人: 環境保護部南京環境科學研究所
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

1.一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）去除待測土樣中的動植物殘體，充分研磨，通過50-60目篩子使得土壤粒徑在0.2mm以下；

2）將研磨后的土樣在高壓濕熱條件下滅菌15-20分鐘；

3）稱取滅菌后的土樣1-2g，放入10ml離心管中進行清洗去除土壤雜質；

4）對去除過雜質的土壤土樣表面進行封閉；

5）對封閉后的土壤土樣進行抗體結合檢測：

5.1）向封閉后的土樣中加入3ml反應液Ⅰ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，50rpm/min，孵育2h，期間每隔20min顛倒離心管數次，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.2）加入洗滌液Ⅱ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min；之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.3）重復步驟5.2）三到五次；

5.4）加入3ml反應液Ⅱ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，50rpm/min，孵育1h，期間每隔20min顛倒離心管數次，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.5）加入洗滌液Ⅱ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min；之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

5.6）重復步驟5.5三到五次；

5.7）加入新鮮配置的3mlTMB顯色液，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，孵育30min，期間每隔10min顛倒離心管數次，孵育結束后加入2M硫酸1ml終止反應，之后10000rpm/min離心5min，取上清液于酶標儀450nm進行檢測。

2.根據權利要求1所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法，其特征在于，所述步驟3）中去除土壤雜質步驟如下：

3.1）加入洗滌液Ⅰ3ml，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，200rpm/min，震蕩10min，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

3.2）重復步驟3.1）一次；

3.3）加入洗滌液Ⅱ3ml，充分搖勻后，水平置于搖床，37℃，200rpm/min，震蕩5min，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

3.4）重復步驟3.3），直到上清液不再有泡沫。

3.根據權利要求1所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法，其特征在于，所述步驟4）中土樣表面進行封閉步驟如下：

4.1）向洗滌后的土樣中加入3ml封閉液，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，50rpm/min，孵育1h，期間每隔10min顛倒離心管數次，之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

4.2）加入洗滌液Ⅱ，充分搖勻后，水平置于搖床，室溫，100rpm/min，震蕩5min；之后10000rpm/min離心5min，棄上清液；

4.3）重復步驟4.2）三到五次即可。

4.根據權利要求2所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法，其特征在于，所述洗滌液Ⅰ配方為：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，2%（m/v）SDS，0.2mmol/LEDTA。

5.根據權利要求2所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法，其特征在于，所述洗滌液Ⅱ配方為：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L。

6.根據權利要求3所述的一種土壤中殘留Bt蛋白的原位酶聯免疫定量檢測方法，其特征在于，所述封閉液配方為：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，8%m/vBSA，0.5%v/vTween-20。